第三章　脐带间充质干细胞的生物学特性

脐带间充质干细胞（umbilical cord mesnchymal stem cells，UCMSC）是来源于新生儿脐带组织的一种具有自我更新能力、多向分化多潜能和较强免疫调节功能的间充质干细胞。间充质干细胞（mesnchymal stem cells，MSC）最早在骨髓中发现，随后发现其广泛存在于脂肪、结缔组织、牙髓、滑膜、脐带、胎盘等连接组织中。UCMSC的基本生物学特性，包括体外生长特性、表型标志、分化潜能、分泌功能、免疫与炎症调节功能等，均与其他来源的间充质干细胞具有相似性，但不同来源的间充质干细胞也存在一定差异，其中UCMSC在生长活性、分化能力及分泌功能方面更强大。UCMSC的最主要生物学特性是：①在体外培养条件下增殖能力旺盛，可以贴壁生长和传代培养，是成体干细胞中材料来源最充足且可实现大规模、标准化增殖培养的成体干细胞之一；②可塑性强，可跨胚层分化，已在体外被诱导分化为神经、肌肉、内皮、肝、胰腺、骨、软骨、脂肪等多种类型的功能细胞，在临床上可用于各种涉及组织损伤、退变的疾病治疗，特别是对一些传统疗法难以治愈的疑难疾病，例如老年性退变、帕金森病、血管缺血性疾病等具有重要意义；③具有良好的免疫调节功能，对自身免疫性疾病和炎症性疾病，例如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、1型糖尿病、感染性或创伤性系统性炎症反应等，具有明确的疗效；④免疫原性低，输入同种异体，甚至异种来源的UCMSC不引起免疫排斥反应，在临床治疗中安全性高，无毒副作用；⑤分泌外泌体和多种细胞因子，通过体外无血清培养上清的蛋白质组学分析发现，UCMSC可分泌数百种涉及细胞生长、分化、合成、代谢相关的因子，其中至少有30种以上可促进损伤组织的原位细胞分裂增殖、血管再生、抑制炎症反应等有利于促进损伤修复的因子；⑥具备“成药”性能和产业化特征，一条脐带可以在体外培养出满足数以万计的临床患者治疗需要的UCMSC，因此可以实现标准化、规模化、工厂化生产并向临床提供标准化的特需“药品”；⑦用于疾病治疗具有多方面的生物效应，适用于涉及组织细胞变性、衰老、死亡、缺失等疾病的治疗，包括缺血、炎症、自身免疫、中毒、机械损伤、衰老等疾病。鉴于UCMSC对疾病治疗及健康保健的重要性和可行性，UCMSC的基础与临床研究受到研究者的高度重视，研究进展十分迅速，预计将成为优先进入临床应用的成体干细胞产品之一。

脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构，一端连接于胎儿腹壁的脐轮，另一端连接于胎盘的胎儿面，脐带内含2条脐动脉、1条脐静脉。脐带最早由羊膜包卷着尿囊和卵黄囊的柄状伸长部而生长形成，随着卵黄囊的逐渐退化，脐血管逐渐形成，血管周围可见疏松的胶状间充质。脐带呈灰白色，长度在30~70cm，平均长度约50cm，直径在1.5~2cm，重量在60~140g。脐带的功能是作为母体与胎儿间气体交换、营养物质供应和代谢产物排除的通道，脐动脉管壁较厚，管腔较小，脐静脉管壁较薄，管腔较大。脐带的解剖结构由三部分组成：最外层为羊膜被覆上皮覆盖，脐血管位于中央，位于两者之间的是黏液结缔组织，由英国解剖学家Wharton于1656年最先描述，因此称之为华尔通胶（Wharton jelly），华尔通胶对脐血管起支撑和保护作用。华尔通胶中存在着一种成纤维样细胞，该细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能，被称为人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesnchymal stem cells，hUCMSC）。一直以来，人们都将分娩后的脐带当作废弃物抛弃，但在脐带发现MSC之后，脐带变废为宝，成了人类干细胞的新来源，人们对其生物学特性及其应用开展了广泛研究，已经成为成体干细胞研究中最具有应用优势的干细胞之一（图3-1）。

近年来，研究者分别从脐带血、脐静脉内皮、脐带华尔通胶等部位分离出间充质干细胞并建立了体外纯化、扩增技术体系，为UCMSC的研究与应用提供了技术和材料。2003年，Erices等首次报道了从脐带血中分离出间充质样细胞，经过鉴定其表型和骨髓间充质干细胞相似，但是数量很少，只占了总检测样本量的1/4；Covas等从脐静脉内皮分离出少量成纤维样细胞，可分化为脂肪细胞和成骨细胞，并表达间充质干细胞的表面标记。Wang等的研究表明，胎儿脐带华尔通胶部位能分离得到大量表达间充质干细胞表面标记的基质细胞，并具有分化为脂肪、软骨、成骨和心肌细胞的能力。美国科学家Mitchell等于2003年从脐带华通胶中分离获得混合细胞，发现其在体外增殖能力极强，可以被诱导分化为神经元和神经胶质细胞。同年，俄罗斯科学家Romanov等也从脐带组织中分离获得间充质干细胞，发现其形态和免疫表型与骨髓间充质干细胞具有相似性，因此认为脐带组织中存在有具备多向分化潜能的多能干细胞。之后关于UCMSC的研究在世界各地广泛开展，证明了从脐带华通胶中分离获得的多能干细胞为间充质类干细胞。2004年，Kim等从脐带组织中分离获得间充质干细胞样细胞，对其表型和分化能力进行了分析研究，证明不表达血管内皮细胞特异性抗原vWF、Fik-1和PECAM-1，可被诱导分化为脂肪细胞和骨细胞。2004年，Panepucci等从脐静脉组织分离获得间充质干细胞，并对其免疫表型、分化潜能等与骨髓间充质干细胞进行了比较研究，发现这两种细胞有相似的基本特性，但在成骨分化能力上有一定差异。2006年，我国科学家Lu等从脐带组织中分离获得间充质干细胞，证明其具有骨髓间充质干细胞的特性，包括生长形态、免疫表型、细胞周期、成骨成脂分化和支持骨髓造血功能等。我国山东大学科学家Ma等于2005年从脐带组织中分离获得间充质干细胞并进一步证明其分化为神经样细胞的能力，诱导细胞不仅在形态上类似神经细胞，而且表达神经细胞的表面抗原标志分子。该课题组于2006年对脐带干细胞的生物学特性进行了进一步研究并将其诱导分为肝细胞样细胞。Friedman等利用GFP基因导入脐带间充质干细胞，分析了该细胞对造血干细胞移植的影响，发现可以促进造血作用，认为脐带间充质干细胞可分泌细胞因子，易于基因转染，可能在细胞治疗中具有广泛的应用前景。Seshareddy等于2008年建立了更为稳定的UCMSC体外培养、扩增、鉴定、储存技术体系，提出了在储存脐带血干细胞的同时，制备并储存UCMSC具有重要的科学和应用价值。同年，台湾学者Chao等成功诱导UCMSC分化为胰岛细胞，诱导后细胞表达胰岛素和C肽，表达胰岛细胞相关基因Pdx1、Hlxb9、Nkx6等，移植入链尿咗菌素诱导的糖尿病小鼠体内具有治疗效果。2008年，Weiss等对UCMSC的免疫特性进行了分析研究，发现具有抑制已被激活的T淋巴细胞增殖的功能，不表达CD40、CD80、CD86等免疫刺激分子，但表达IL-6和血管内皮生长因子，分泌细胞因子支持造血功能，提示采用异体来源UCMSC移植治疗不会产生明显的免疫排斥反应。Zhang等人于2009年报道将脐带间充质干细胞诱导分化为肝细胞样细胞，诱导细胞表达干细胞相关的抗原标志分子。同年，Kadivar等将脐带间充质干细胞诱导分化为心肌细胞，认为脐带间充质干细胞可能成为心脏细胞的新来源。在2009年，有多家实验用UCMSC移植治疗肺纤维化、肝纤维化、软骨损伤，结果均证明可有效减轻组织器官的纤维化程度并可促进损伤修复。

在体外培养技术体系方面，2011年Venugopal等建立了异体人血清联合碱性成纤维细胞生长因子（2ng/ml）替代胎牛血清的UCMSC体外分离扩增方法并与添加10%牛血清的方法进行了比较研究，证明在生长能力、免疫表型、分化潜能等方面没有显著差异，为避免使用牛血清带来的传播未知病原的风险奠定了技术基础。2014年，Swamynathan等建立了临床级无血清UCMSC大规模分离、扩增技术体系，推进了UCMSC的临床转化应用。之后，人们对UCMSC的培养体系进行改进，提高了获得效率，同时还对其生物特性进行了系统研究并与骨髓、脂肪等来源的MSC进行了基因表达谱和分化潜能的比较研究，初步解决了UCMSC的来源和标准化问题。

2011年之后，UCMSC的研究主要集中于功能研究方面，特别针对UCMSC的免疫调节、抑制肿瘤生长、人类疾病模型治疗和临床研究等在国内外广泛开展。2012年，Chen等对UCMSC的免疫相关基因表达、免疫细胞功能调控、心率患者治疗后的免疫球蛋白表达等调节免疫特性进行了系统研究，证明UCMSC表达HLA-E、HLA-G、HLA-F和免疫调节基因 VEGF、TGF-β、HGF、HMOX1、IL-1β、IL-6、LIF、COX1/2 和 PTGF，但不表达免疫反应性基因HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、CD80、CD86、CD40和 CD40L。将UCMSC 用于心律失常患者治疗后，对患者的T淋巴细胞亚群和免疫球蛋白IgG/IgM无显著影响，表明UCMSC的低免疫原性是通过表达免疫调节分子实现的，用于心脏修复治疗后不引起患者免疫功能的显著改变。2012年，Li等报道进行了UCMSC治疗系统性炎症反应和LPS诱导的急性肺损伤的研究，证明UCMSC治疗可提高模型动物的存活力，抑制系统性炎症反应和修复肺损伤，降低氧化应激反应。同年，Shi等进行了24例肝衰竭患者的UCMSC临床治疗试验，结果表明，UCMSC治疗可提高生存率和生活质量，改善终末期肝损伤相关指标，提高血浆白蛋白含量，增加血小板数量，提示UCMSC对肝衰竭产生了治疗作用。还有人进一步研究发现UCMSC分泌的外泌体也可有效治疗肝衰竭，因此认为UCMSC释放的外分泌体可能是其对肝衰竭治疗发挥作用的重要机制，但这种观点不够全面，因为UCMSC本身及其分泌的生长因子也可能参与了治疗作用的发挥。Meng于2003年用UCMSC治疗兔急性胰腺炎，发现移植UCMSC可显著抑制炎症反应和减轻胰腺损伤，由于急性胰腺炎是临床上比较头痛的难治性疾病，该研究为该病治疗提供了新的思路。2014年，成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心将UCMSC用于系统性红斑狼疮治疗，结果显示UCMSC可抑制自身免疫反应，炎性反应程度降低，组织损伤减轻，促进肾功能改善，其中多例出现尿蛋白升高的肾功能异患者获得治愈，但长期随访发现部分患者因未继续接受UCMSC治疗而复发。我们的临床研究结果表明，UCMSC对系统性红斑狼疮的治疗有确切疗效。同年，Wang等进行了UCMSC治疗系统性红斑狼疮的临床研究，结果同样证明UCMSC对系统性红斑狼疮有显著疗效。2014—2016年间，国内外有多家实验室进行了UCMSC之类类风湿关节炎、神经损伤、放射伤、代谢综合征、肾损伤、肺损伤、血管缺血性疾病的动物疾病模型和临床治疗研究，证明UCMSC具有抑制自身免疫反应和炎症反应、促进损伤修复、改善临床症状等功能，这些研究说明UCMSC对自身免疫反应、组织损伤及缺血性疾病的治疗。

2003年以来，关于UCMSC治疗及机制研究的报道日益增多，国内多家研究机构完成了UCMSC体外分离、扩增、鉴定、储存及临床制剂标准化研究，通过动物模型证明了MSC具有促进损伤修复、改善血液循环、抑制炎症反应和调节免疫平衡等作用，一些临床研究进一步证实了UCMSC治疗的疗效、安全性和机制。2016年，本课题组利用心肌纤维化、肺纤维化、慢性阻塞性肺炎、创伤性系统性炎症反应及老年性退变模型评价了UCMSC的疗效和机制，初步取得一定疗效，表明UCMSC可能成为临床疾病治疗的有效“药物”，在自身免疫、急慢性损伤、老年性退变及人体生物组织工程方面有广阔的应用前景。

综合国内外关于UCMSC的研究报道不难看出，已经有大量的临床研究证明了UCMSC移植治疗的安全性、有效性，由于急慢性炎症反应、免疫功能异常是许多疾病发生发展的重要机制，UCMSC对许多疾病发挥治疗作用的机制可能是通过调节免疫平衡和抑制抗炎反应，降低炎症反应程度和抗细胞凋亡而最终改善损伤组织的结构与功能。UCMSC还可通过旁分泌作用，分泌各种细胞因子和外分泌体来调节局部微环境，使得损伤细胞保存生理功能。相关的细胞因子如VEGF等，在心血管疾病中可以加强UCMSC的迁移与归巢，促进血管生成，降低缺血性心肌凋亡的发生，减少心肌梗死的范围。而在安全性和有效性方面，大量的临床前及临床试验显示，UCMSC移植对心血管疾病具有治疗作用，并且是安全的。肝病方面的动物实验及人体试验表明，UCMSC移植可以减缓肝硬化进程，并不同程度的逆转肝纤维化，改善肝脏合成功能，延长患者寿命，提高获得肝脏移植的机会和成功率。