第三章　免疫抑制剂血药浓度监测

免疫抑制药物的浓度必须保持在一个安全、有效的剂量范围内，才能起到有效的治疗作用，免疫抑制药物浓度过高可导致严重的不良反应，包括导致移植受者对感染和肿瘤的免疫力下降，增加受者继发感染和肿瘤的风险；而免疫抑制药物浓度过低，则无法达到对抗供体免疫反应的强度，从而产生器官排斥反应。

免疫抑制剂的有效治疗浓度通常在一个极窄且多变的水平，免疫抑制药物在体内的代谢速度因个体差异而差别巨大，受移植受者个体的年龄、体重、遗传因素、环境因素、胃肠道等功能差异和不同药物间相互作用等诸多因素的影响，在用药时，要根据移植患者个体指标，来选择恰当的免疫抑制剂，并依据监测的药物浓度调整免疫抑制剂的用量，还要根据药物在体内的代谢情况来选择服药时间和给药途径。因此，定期进行免疫抑制剂药物浓度监测，对于器官移植受者药物治疗策略的选择具有重要的指导意义，可以辅助医生在非常窄的治疗窗内优化给药剂量，从而确保既能有效预防器官排斥反应，又能避免严重不良反应的发生。

临床上常用的免疫抑制剂血药浓度监测的方法如下[1]。

第一节　免疫学方法

免疫分析方法的原理是待测药物和标记后的该药物与特异性抗体竞争有限的结合部位，血样中的未标记药物浓度取决于标记药物与特异性抗体结合的量，标记物可能是放射性同位素、酶、荧光或化学发光物质，依据标记物的属性，可分为以下几种方法：

一、化学发光微粒子免疫检测法（chemiluminescentm icroparticle immunoassay，CM IA）

化学发光微粒子免疫检测法是采用磁性微粒作为固相载体，在酶促化学发光或非酶促化学发光系统中，以竞争法或双抗体夹心法等免疫测定方法为基础，测定试样的浓度。CMIA法将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，适用于各种抗原、抗体、激素及药物等的检测分析。

二、均相酶免疫测定法

均相酶免疫测定法包括酶放大免疫测定法（enzyme-mutiplied immunoassay technique，EMIT）和克隆酶供体免疫测定法两种。免疫抑制剂血药浓度检测主要以EMIT法为主，其原理为酶标半抗原会因结合抗体而影响酶的活性，抑制酶的底物催化反应。检测时，将酶标半抗原（药物分子）和含有待测药物的血浆共同与抗体作用，因竞争抗体结合位点，血浆待测药物浓度与酶活性（未结合抗体的酶标半抗原量）成正比，再通过分光光度计检测观察动态吸光度的改变，从而测量血浆药物分子的浓度。EMIT技术操作简单、快捷，无需前处理，用样少，可处理高通量样本和急诊样本，是临床常用的免疫抑制剂检测方法。

三、放射免疫法

放射免疫法是利用放射性同位素标记抗原，与未标记的待测抗原混合，共同与抗体作用，同样采用竞争抗体结合位点的原理，待测抗原浓度与放射性同位素标记抗原抗体复合物的量成反比，通过检测抗体的放射性，计算待测抗原的浓度。放射免疫法具有精确度高、灵敏度高的特点，对于微量定量具有较大的优势，但因其存在放射污染，逐渐被化学发光免疫法、酶免疫分析法等方法取代。

四、荧光偏振免疫法（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）

荧光偏振免疫法是依据荧光标记抗原和其抗原抗体复合物之间荧光偏振程度的差异，用竞争性方法直接测量溶液中小分子的含量。在反应体系内加入未标记抗原（待测药物）和一定量用荧光素标记的小分子抗原，使两者与特异性大分子抗体竞争结合。荧光偏振程度与待测抗原浓度呈反比关系。FPIA法的优点是灵敏度高、精密度高、速度快、操作简便，样品用量少，但其检测仪器设备昂贵，药品试剂盒专属性过强。

五、酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。该法适于测定细胞培养上清、血清、血浆及组织液中的样本，具有方法简单、方便快捷、特异性强的特点。微粒子酶联免疫吸附法（microparticle enzyme linked immunoassay，MEIA）是一种新型改进型的ELISA检测法，其原理是将抗体包被在微粒子上，与待测药物混合，再加入酶标抗体，形成微粒子抗体-抗原-酶标抗体复合物，微粒子用于捕获待测抗原分子，标记酶催化底物反应发射荧光，最后用荧光读数仪记录、放大并计算处待测分子的含量。

第二节　色谱法

色谱法是利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。色谱法灵敏度高、选择性强，可同时测定多种药物及其代谢产物，但其测定周期长，测定分析技术难度高。主要用于免疫抑制剂。血药浓度监测的色谱法包括单用的高效液相色谱法或与质谱联用的方法。

一、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）

HPLC法工作原理是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。HPLC法能够用于大部分药物浓度的定量分析，具有速度快、分辨率高、灵敏度高、分离柱可反复使用，样品量少且易回收等特点。

二、液相色谱-质谱/质谱联用法（liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer，LC-MS/MS 法）

液相色谱LC与高选择性、高灵敏度的串联质谱MS/MS结合，可对复杂样品进行实时分析，即使在LC难分离的情况下，只要通过MS1及MS2对目标化合物进行中性碎片扫描，则可发现并突出混合物中的目标化合物，显著提高信噪比。作为一种新兴的分离检测技术，近来发展极为迅速，在生命科学、环境科学、法医学等多领域都有广泛应用。

第三节　高效毛细管电泳法

高效毛细管电泳法（high performance capillary electrophoresis，HPCE）指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据待测样品中各组分之间淌度和（或）分配行为上的差异而实现分离的一种液相分配技术，是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物。与HPLC相比，HPCE的特点是分析速度快、效率高、前处理简单、样品用量小、不易产生柱污染。其应用范围广，可用于药物、离子、蛋白质、多肽、氨基酸、DNA、RNA、无机物、有机物、单细胞等分析[2]。

目前临床应用的免疫抑制剂基本可以分为五大类：细胞因子抑制剂，如环孢素（CsA）、他克莫司（FK506）、西罗莫司等；DNA合成抑制剂，如吗替麦考酚酯（MMF）、硫唑嘌呤（Aza）等；肾上腺皮质激素类，如泼尼松、甲泼尼松等；抗淋巴细胞抗体，如抗淋巴细胞球蛋白（ALG）、抗胸腺球蛋白（ATG）等；其他免疫抑制剂，如FTY720、AEB071、环磷酰胺等。这里主要介绍他克莫司、环孢素、吗替麦考酚酯、麦考酚钠肠溶片及西罗莫司在血液中浓度的监测方法。

第四节　几种主要免疫抑制剂的血药浓度监测

一、钙调磷酸酶抑制剂（calcineurin inhibitor，CNI）

（一）他克莫司（tacrolimus，Tac，FK 506）

他克莫司又名FK506，其血药浓度与免疫抑制强度和毒副反应相关，不仅治疗窗窄且药代动力学个体差异大。FK506在血液中绝大部分分布于红细胞，血浆药物浓度与全血药物浓度不一致，临床目前使用全血样本检测患者体内的药物浓度。FK506血药浓度检测血样采集时间为患者次日晨服药前（谷值），抽取全血1ml置于EDTA抗凝试管中。采用校准品制作标准曲线，以此为基础计算结果。

目前临床常用的FK506血药浓度监测方法有CMIA法、EMIT法、ELISA法、LC-MS/MS法及HPLC法。LC-MS/MS法被视为FK506血药浓度检测的“金标准”，其方法学不受FK506代谢产物的影响，特异性高、灵敏度高、检测限低（0.1ng/ml），但因其设备成本高，特别对操作人员的专业技术水平要求高，样品前处理过程较繁琐、时间长，前处理方法学、色谱、质谱条件等因不同实验室而难以标准化操作，目前仍多应用于实验室研究，在临床常规检测中难以普及应用。而免疫分析法因试剂商品化、自动化程度高、准确性和重复性较好、检测速度快、操作方便等特性，在临床常规检测中得以广泛应用。比较常用的几种免疫分析方法：CMIA法和EMIT法在国内均有商业公司开发的商业仪器使用，具有自动化程度高、操作简单、测试速度快（1小时）、所需样品量较少的特点，临床应用较成熟，均是国内广泛使用的检测方法。ELISA法的准确性和敏感性较好，设备及试剂成本较低，但检测过程较为繁琐，试验用时长约4小时，且对FK506专属性较差，FK506及其代谢产物存在交叉反应，结果的准确度或受到干扰[3]。

患者的个别情况会干扰FK506浓度测定结果，应注意分析：以CMIA法为例，当胆红素＞40mg/dl、蛋白质＞25g/dl、三酰甘油＞800mg/dl或尿酸＞40mg/dl时，实际结果＜测定值12%；如有胆汁淤积时，实际结果＜测定值；经小鼠单抗治疗患者，血中可能产生了抗鼠抗体，会影响测定结果。

（二）环孢素（CsA）

CsA的药代动力学个体差异大，其血药浓度与疗效及毒性密切相关，监测全血中CsA的血药浓度是临床常规项目。大型病例的研究表明，患者CsA浓度-时间曲线下面积（area under the curve，AUC）是移植物存活和急性排斥反应发生的敏感预测因素，而个体内CsA的AUC变异性则是慢性排斥反应的危险因素之一。获得准确的AUC需要在给药后12小时内多次采血测定，操作复杂、费用昂贵、不便临床应用。研究发现，服药后2小时的CsA浓度C2与AUC相关性最大，此时CsA达到最高浓度，因此，临床医师主要依靠患者CsA血浓度谷值（C0）和C2来指导临床用药。送检标本最好为肝素抗凝全血。

CsA血药浓度检测法有EMIT法、ELISA法、放射免疫法（RIA）、FPIA 法、HPCE法、HPLC法、LCMS/MS法等。HPLC法和LC-MS/MS法检测结果准确，可区分CsA母药和代谢产物，但耗时较长，操作过程复杂，技术要求高，不能进行批量样品操作，在临床应用上受到限制。EMIT法和FPIA法是目前临床上采用的主要方法，具有灵敏、快速、自动化程度高的优点，检测过程在1小时以内，当测试完毕后，检测仪器可自动根据标准曲线计算待测样本的CsA浓度。放射免疫法采用放射性核素3H或125 I标记CsA作为示踪剂，也具有灵敏度高、精确度高的特点，在具有放射性核素检测资质的中心，也是可选用的检测方法。

二、霉酚酸类抑制剂

吗替麦考酚酯（MMF），商品名为骁悉，及麦考酚钠肠溶片，商品名为米芙，均是霉酚酸（MPA）的合成脂类前体药，两者进入体内后，吸收时间及效率不同，在体内的有效成分均是MPA。MPA在人体内药代动力学个体差异大，对服用MPA的患者进行血药浓度监测，可防止或减少药物的毒性及不良反应，延长移植物存活期。98%的MPA与血浆蛋白结合，送检样本最好是EDTA抗凝管全血。MMF的监测时间为次日清晨服药前30分钟（C0谷值）、服药后半小时（C0.5）及服药后2小时（C2），麦考酚钠肠溶片的监测时间为C0、服药后1小时（C1）和C2。

MPA的检测法主要包括EMIT法和LC-MS法。①LC-MS法同样因操作复杂、耗时较长而临床应用较少；②EMIT法是最常用的方法，可采用商业化仪器及试剂检测，批量操作，快速准确。

MPA的清除受以下方面的影响：肝、胃肠道和肾中葡萄糖醛酸转移酶（UDP）；MPA的肠肝循环；MPA的游离部分比例；急慢性肾功能失活；其他免疫抑制剂的影响；移植后的时间及种族因素。

三、西罗莫司

西罗莫司商品名为雷帕鸣，可阻断T淋巴细胞和B淋巴细胞的钙依赖性和非依赖性信号转导通路，其有效血药浓度范围窄，血药浓度偏高可引发肝肾毒性反应及副作用，偏低会导致排斥反应，在抗排斥治疗过程中所用的影响细胞色素P4503A酶系的药物均能引起血药浓度改变。因此，临床要求对其血药浓度进行监测，制订个体化治疗方案。西罗莫司的血浆蛋白结合率＞92%，最好采集全血置于抗凝管内进行检测，采样时间为次日清晨服药前30分钟（C0谷值）。

监测西罗莫司血药浓度的方法有CMIA法、MEIA法、HPLC法和LC-MS/MS法等。HPLC法和LCMS/MS法检测结果准确，但因操作复杂、耗时较长而影响临床应用。CMIT法和MEIA法是临床广泛采取的免疫学检测方法，因试剂及检测仪器已商品化，具备自动化程度高、重复性好、检测速度快、操作方便等特性。

西罗莫司联合CsA或FK506用药，既可减少药物剂量，减轻毒性反应，又可避免因单用药剂量不足诱发的排斥反应，增强免疫抑制效果[4]。

免疫抑制剂血药浓度的监测：

1.推荐检测CNI的血药浓度（1B级）。检测频率至少应该达到：移植术后短期内隔日检测，直至达到目标浓度（2C级）；在更改药物或受者状况出现变化可能影响血药浓度时，随时测定（2C）；出现肾功能下降提示有肾毒性或排斥反应时，随时测定（2C）。

2.建议用于监测CsA血药浓度的指标（2D）：服药后12小时谷浓度；服药后2小时血药浓度或浓度时间曲线下面积（area under the curve，AUC）。

3.在CsA+MPA类药物+激素的三联方案中的CsA 的血药谷浓度与峰浓度（C2），CsA的目标谷浓度参考值：术后1个月内200～350ng/ml，1～3个月150～300ng/ml，3～12个月100～250ng/ml，1年以上大于50ng/ml。CsA的目标血药峰浓度参考值：术后1个月内1000～1500ng/ml，1～3个月800～1200ng/ml，3～12个月600 ～ 1000ng/ml，1年以上大于400ng/ml。

4.建议用于监测他克莫司血药浓度的指标（2C）：服药后12小时谷浓度。在他克莫司+MPA类药物+激素的三联方案中，他克莫司的目标谷浓度参考值：术后1个月内10～15ng/ml，1～3个月8～15ng/ml，3～12个月5～12ng/ml，1年以上5～10ng/ml。

5.对于新生抗供体特异性抗体（de novo donor special antibody，dnDSA）阳性且肾功能稳定的肾移植受者，建议维持他克莫司谷浓度大于6ng/ml。

（谢林　王康　刘洪涛）

参考文献

1.付鹏.免疫抑制剂的治疗药物监测概况及研究进展.实用器官移植电子杂志，2015，（05）：307-312.

2.王燕，卜雯婷，李鹏飞等.常用免疫抑制剂人血中定量监测方法研究进展.中国临床药理学与治疗学，2011，（07）：830-836.

3.钱文璟，李璐，田洁等.酶放大免疫测定法和酶联免疫吸附法测定他克莫司血药浓度的比较.中国药房，2013（26）：2424-2427.

4.中华医学会器官移植学分会.中国肾移植受者哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂临床应用专家共识.中华器官移植杂志，2017，38（7）：430-433.