第一节 提取、分离
一、游离多糖的提取
对于游离多糖，可在对原料进行粉碎后用水或盐溶液直接进行提取。对于易溶于温水难溶于冷水的多糖，应进行加温提取。有些多糖在中性水溶液中的溶解度较小，可根据其溶解特性调节适当的pH进行提取。
多糖在提取液中的浓度一般均较低，需在提取后对提取液进行浓缩，浓缩的方法可根据多糖的性质确定。如对于对热比较稳定的多糖，可用加热蒸发或减压蒸除水分法；对于Mr大的多糖可用超滤浓缩法；向多糖溶液中加入一定量的有机溶剂（如乙醇）可得到粗多糖沉淀物。
二、结合多糖的提取
结合多糖的提取主要介绍黏多糖。以新鲜组织或丙酮脱脂脱水的组织为原料，可用水或盐溶液提取部分黏多糖。但是，因大部分黏多糖是与蛋白质相结合的，需用酶降解蛋白质部分或（和）用碱使多糖与蛋白质间的糖肽键裂开以促进黏多糖在提取时的溶解。
（一）非降解法
用水或盐溶液直接从组织中提取黏多糖的方法，适用于与其他组织连接不牢固的黏多糖或其蛋白复合物的提取，如从眼玻璃体、脐带、关节滑液中提取透明质酸。用本法提取的黏多糖仍结合有蛋白质，需用酶解等方法去除。
（二）降解法
1.碱处理法
本法的主要依据是蛋白质—多糖结合物的糖肽键对碱不稳定。碱处理法的优点是可以从组织中对黏多糖进行较完全的提取，例如，已经成功地用此法从软骨中提取硫酸软骨素。此法的缺点是，黏多糖分子有从裂解的一端被碱进一步降解的可能。所以，如果希望多糖成分在特定的范围内保持分子完整，则不宜用此法，或尽可能地使用稀碱并避免高温。
2.酶处理法
用蛋白酶消化与多糖结合或共存的蛋白质，是常用的从组织中释出黏多糖的方法之一。通常选用专一性低的蛋白酶以进行广泛的蛋白质水解，常用的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶及链霉蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶等一些微生物来源的酶。
三、多糖的分离纯化
（一）多糖中杂质的去除
多糖中的杂质主要是蛋白质、小分子降解产物、有色物质等。
1.蛋白质的去除
用乙醇沉淀等方法从提取液中获得的多糖仍含有残存的蛋白质，应予以去除。去除残存蛋白质的方法有等电点沉淀法、加热变性法、蛋白质沉淀剂法等，也可两种或两种以上的方法结合使用，如调pH与加热相结合。对于结合于多糖分子上未完全水解的蛋白质，可选用较高纯度的蛋白酶进行水解，最好选用与提取时使用的不同的酶。
2.小分子杂质的去除
在多糖的粗提物（特别是降解法制得的粗提物）中，常含有一些小分子的消化产物，应予去除。去除多糖中小分子物质最常用的方法是透析法和超滤法，这两种方法均是根据大分子物质不能透过半透膜而小分子物质可透过半透膜的性质进行分离的方法，特别是超滤法，适合于大规模生产。用乙醇或季铵化合物沉淀黏多糖，使小分子的消化产物存留于上清液中，也是在生产中最为常用的有效方法。
3.有色物质的去除
有色物质是多糖产品中的常见杂质。常用的去除方法是氧化法，常用的氧化剂为高锰酸钾和过氧化氢。但是，这些强氧化剂可将多糖末端的醛基氧化成羧基，也可引起部分糖苷键的断裂。在偏酸性和加热的条件下使用活性炭也可脱去多糖中的大部分有色物质，但在此条件下可引起降解反应和含硫酸基多糖脱硫酸基。应用超滤技术也可除去部分小分子的有色物质。
（二）黏多糖的分级分离
黏多糖的分级分离主要有两个目的：一是对不同黏多糖混合物进行分级分离以获得一种黏多糖；二是对一种黏多糖进行分级分离以获得不同性质（如Mr不同）的组分。对黏多糖进行分级分离的方法有很多，其中利用黏多糖在乙醇中的溶解度不同是最为常用的简单而有效的方法。根据黏多糖阴离子电荷密度的不同，可利用季铵络合物的生成、离子交换层析和电泳进行分级分离。根据Mr大小的不同，用凝胶层析、超滤等技术进行分级分离也是工业生产常用的方法。
1.乙醇分级沉淀
乙醇沉淀（ethanol precipitation）是一种从溶液中回收黏多糖的常用方法。由于不同性质或不同Mr的黏多糖沉淀所需乙醇浓度不同，故乙醇分级沉淀（ethanol fractional precipitation）可用于样品中不同黏多糖组分的分级分离。此方法既可用于不同性质的黏多糖的分级分离，又可用于同一种类的黏多糖不同Mr组分的分级分离。例如，用1.25倍乙醇沉淀软骨消化液可得几乎纯的硫酸软骨素，而硫酸角质素和另外某些硫酸软骨素则保留于乙醇上清液中。在肝素纯化过程中，用42%的乙醇浓度可沉淀得到平均Mr为17kD左右的肝素，进一步将乙醇浓度提高到80%，可沉淀得到平均Mr为11kD的低抗凝活性肝素。
虽然乙醇分级分离为一种很有用的方法，但也有其弱点，即对一组差异较小的多种成分不能达到完全地分级分离。
2.季铵化合物沉淀
黏多糖的聚阴离子与某些阳离子表面活性物质如十六烷基吡啶盐、十六烷基三甲基铵等能形成季铵盐化合物，这些化合物在低离子强度的水溶液中不溶解，在高离子强度的溶液中可以解离并溶解。不同的黏多糖聚阴离子电荷密度不同，使其络合物溶解时所需盐的浓度也不同，因而可用于分级分离，称为季铵化合物沉淀法（quaternary ammonium compound precipitation method）。
3.离子交换层析
离子交换层析（ion-exchange chromatography，IEC）是根据溶液中各种带电颗粒与离子交换剂之间结合力的差异进行分离的技术。黏多糖由于具有酸性基团如糖醛酸的羧基和不同部位的硫酸基，在溶液中以聚阴离子的形式存在，从而可用阴离子交换剂进行交换吸附。对吸附后的树脂，可用逐步提高盐浓度的办法来进行洗脱，以获得不同的黏多糖或组分。如用Dowex 1柱对黏多糖混合物进行分离时，分别用0.5、1.25、1.5、2.0和3.0mol/L氯化钠溶液洗脱，可以分离透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、肝素和硫酸角质素。
4.凝胶层析
凝胶层析（gel chromatography），也称凝胶过滤（gel filtration），是指混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物因分子大小不同而被分离的技术。根据黏多糖Mr大小不同，可选用合适的具有分子筛性质的凝胶，如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等进行分级分离。其中最常用的是葡聚糖凝胶，例如用Sephadex G-75分级分离低分子肝素。
5.超滤
超滤（ultrafiltration）是在一定压力下，使用一种特制半透膜对混合溶液中不同溶质分子进行选择性过滤的分离方法。利用超滤对黏多糖进行分级分离也是基于黏多糖Mr大小的不同，可根据需要，选用具有合适的Mr截留值的膜。这种方法的优点是适用于大规模生产，可使存在于截留液中的黏多糖得到浓缩，同时，小分子杂质得到除去。但这种方法的分级分离效果不如凝胶过滤法好，往往在某一Mr范围为主的组分中还含有一定的Mr或高或低的组分。
四、多糖的纯度鉴定
多糖纯度与通常化合物的纯度标准不同，可有多方面的意义或标准，概括起来主要包括三个方面：①多糖中含非多糖物质的量；②一种多糖产品中含其他种类多糖的量；③同一种多糖中不同组分（如Mr不同的组分）所占的比例。因此，纯度鉴定的目的不同，采取的方法也不同。
（一）鉴定多糖中的非糖物质
多糖中的非糖物质主要是蛋白质、核酸、无机盐等杂质。
1.蛋白质的鉴定
鉴定多糖中是否含有蛋白质有多种方法。其中，最简单的是紫外扫描法，因为多糖一般在波长280nm附近没有特征吸收，而蛋白质在波长280nm附近有吸收，如果多糖样品的紫外扫描图谱在波长280nm处无吸收，则可判定样品基本不含蛋白质；还可用蛋白质的显色反应和含量测定方法进行多糖样品中蛋白质的定性与定量分析；电泳后用蛋白质染色剂（如考马斯亮蓝）染色也可鉴定多糖中的蛋白质。
2.核酸的鉴定
鉴定多糖中是否含有核酸最简单的方法也是紫外扫描法，如果多糖样品的紫外扫描图谱在波长260nm处有吸收，则证明样品中可能含有核酸。
荧光染料溴乙锭（ethidium bromide，EB）可插入到核酸碱基对之间，与双链的DNA以及具有双链螺旋区的RNA有特异的结合能力，使EB-核酸络合物的荧光强度比游离EB显著增加，达80～100倍。在对多糖样品进行电泳的琼脂糖凝胶中加入溴乙锭，电泳结束后在紫外灯下观察，如样品中有核酸的存在将有荧光斑点。
3.无机盐的测定
在用乙醇沉淀法制备多糖时，常需加入一定浓度的无机盐（如氯化钠）以利于沉淀。如果掌握不好，加入的乙醇浓度过大或加入的无机盐过多，可使无机盐沉淀并混入样品中。检查多糖样品中无机盐的量最常用的方法是炽灼残渣（也称灰分）试验，即将样品在高温下加热，多糖等有机物氧化分解后变成二氧化碳、水等挥发，称量剩下的无机盐的重量，如果无机盐的含量超出一定的范围，则证明含有无机盐杂质。
（二）鉴定多糖中其他多糖
常用电泳法鉴定多糖中其他多糖，如醋酸纤维素薄膜电泳、玻璃纤维纸电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、琼脂糖电泳等。常用的显色剂有阿利新蓝、甲苯胺蓝等。不同的多糖所含带电基团的性质或数量及Mr有差别，表现在电泳行为上也有差别，即在电泳时移动的速度不同，因此电泳图谱可出现不同迁移率的带。如果同时进行已知多糖对照品的电泳，可根据同种多糖迁移率相同的规律鉴定出样品中含哪种杂质多糖。
（三）鉴定一种多糖中不同组分
由于多糖是大分子物质，在提取、纯化过程中会发生不同程度的降解，从而常产生不同Mr的组分，多糖所含组分或Mr分布是多糖研究和质量控制的重要指标之一。常用的方法有PAGE法和凝胶层析法，如果PAGE呈一条带且很集中，则说明多糖样品Mr较为均一，不含其他组分；如果凝胶层析呈现一个洗脱峰且峰较窄，也说明多糖样品Mr是较为均一的。