第二节　甲状腺肿瘤分子流行病学

分子流行病学（molecular epidemiology）是应用先进的实验技术测量生物学标志物，结合流行病学现场调查的方法，从分子水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程，并提出与评价相应防治措施的科学。这一定义包含了几个要点：分子流行病学是流行病学的一个分支，是传统流行病学与新兴生物技术特别是分子生物学技术之间的一门交叉学科；分子流行病学的主要研究对象是各种生物学标志物；与传统流行病学不同，分子流行病还研究暴露因子引起疾病的相关过程，以测定各种易感性标志，并提出针对性预防措施，尤其是阻断暴露因子进入体内后致病进程的初级预防措施。

肿瘤分子流行病学（molecular cancer epidemiology）一词是Perera和Weinstein于1982年首次提出，他们提出的肿瘤分子流行病学是一种方法，应用先进的实验室技术结合分析流行病学，以生化或分子水平研究肿瘤病因。肿瘤分子流行病学采用流行病学研究方法，结合分子生物学等新兴学科的理论和技术平台，通过对有代表性人群从接触危险因素、癌前病变发展到肿瘤形成过程中一系列肿瘤标志物的研究，可以准确地测量“暴露”、生物学效应和遗传易感性，探讨肿瘤发生的机制。

没有肿瘤标志物就无所谓肿瘤分子流行病学。肿瘤标志物是连接实验室检测和人群为基础的流行病学研究的桥梁，是在癌前病变或癌症中发生生物学或生物化学改变的分子或过程。肿瘤标志物既可由肿瘤细胞或周围的正常组织产生，又可以是机体对肿瘤刺激的反应性产物。对肿瘤标志物的研究有助于揭示从致癌因素暴露到肿瘤发生的“暗箱”，从而揭示肿瘤发病的本质，这正是肿瘤分子流行病学同经典的肿瘤流行病学的本质差异（图5-2-1）。肿瘤标志物的应用主要在如下两个方面：通过对研究对象的定性或定量检测，可以评估致癌物暴露和机体遗传易感性的单独或联合作用，有力地促进肿瘤病因学研究；可以作为临床上评价预后和机体治疗反应的标志来替代临床试验的真正终点，达到证实肿瘤存在、解析病程、评价疗效及复发、判断预后、从而达到辅助临床治疗的目的。

肿瘤标志物分类：按照肿瘤标志物在从暴露到疾病连续过程中所处的不同阶段可以分为暴露标志、效应标志和易感性标志；根据功能可将肿瘤标志物分为诊断标志物、预后标志物、预测标志物和监测标志物。

我国约在20世纪90年代中期开展了肿瘤分子流行病学这一领域的研究。随着大量甲状腺癌流行病学研究和分子生物学研究工作的开展，已发现了许多生物标志物、基因多态性与甲状腺癌的发生有关，丰富了对甲状腺癌发生、发展过程的认识，为甲状腺癌的早期诊断和预后评估打下了理论基础。本章从甲状腺癌病因、诊断和疾病进展相关的生物标志物、基因多态性以及相关基因突变等方面，对甲状腺癌分子流行病学的研究进展进行介绍。

一、生物标志物

（一）降钙素

降钙素（calcitionin，Ct）是由 32个氨基酸组成的多肽，主要由甲状腺滤泡旁C细胞分泌，是MTC较敏感且特异的肿瘤标志物。

2015年美国甲状腺协会（ATA）《修订版甲状腺髓样癌处理指南》推荐血清Ct及癌胚抗原（CEA）的联合检测，对MTC早期诊断、治疗监测、判断手术效果和观察肿瘤复发等具有重要意义。对甲状腺结节患者进行血清Ct筛查有利于早期诊断MTC。Ct同时可作为术后病灶残留或复发的预测因子，在全部甲状腺切除后，Ct水平持续升高则说明有残余肿瘤组织形成，术后Ct激发试验亦可帮助评估肿瘤切除的彻底性。

（二）甲状腺球蛋白

甲状腺球蛋白（thyroglobulin，Tg）是甲状腺滤泡上皮细胞合成与分泌的有功能的糖蛋白复合物，受促甲状腺激素（thyrotropin，thyroid stimulating hormone，TSH）调节，其主要生物学作用是促进甲状腺激素的碘化合成及合成后的储存。

血清Tg检测是分化型甲状腺癌（differentiated thyroid carcinoma，DTC）关键的血清学指标，其在DTC的术前诊断及术后的监测中均起到非常重要的作用，术前血清Tg水平能够作为超声和FANB诊断甲状腺结节的辅助指标，尤其对术前超声及FNAB无法明确诊断的滤泡性肿瘤，血清Tg水平具有很大的恶性诊断价值。血清Tg水平与DTC原发灶的直径及是否有远处转移均有密切的联系。对于接受过全甲状腺切除及131 I治疗的患者，血清Tg检测是评价DTC复发和选择后续治疗的重要参考。2015年，ATA指南指出，对未进行全甲状腺切除和清甲治疗的患者，需通过监测动态Tg水平评估是否复发和转移。血液内抗甲状腺球蛋白抗体（TgAb）会对Tg检测准确性产生干扰，因此对患者检查血清Tg时应同时检测TgAb。

（三）半乳糖凝集素3

半乳糖凝集素3（galectin-3，Gal-3）是凝集素家族的成员之一，主要存在于细胞质，也可存在于细胞表面及细胞外。Gal-3参与多种生理和病理过程，包括细胞生长和凋亡、细胞黏附、新血管形成、肿瘤浸润与转移。Gal-3在FTC和PTC中高表达，而在ATC或MTC中不表达或弱表达。Gal-3是甲状腺恶性病变尤其是乳头状肿瘤和滤泡性肿瘤的强有力指标；Gal-3可以用作FNAB的辅助手段。因而Gal-3是DTC辅助诊断的一种可靠肿瘤标志物。

（四）间皮瘤抗原-1

间皮瘤抗原-1（HBME-1）是间皮细胞微绒毛表面特异性标志物，是间皮瘤相关抗体，在肿瘤血管的形成、生长及转移等方面发挥重要作用。最初在恶性间皮瘤中被发现，早期学者发现它也在滤泡起源的甲状腺癌中表达，尤其是PTC。多项研究显示HBME-1在DTC中呈高表达，而在未分化癌和良性病变中为阴性或部分表达。HBME-1是鉴别良恶性病变敏感而准确的标志物，HBME-1和CK19的联合测定可提高诊断甲状腺癌的准确性。HBME-1，CK19和Gal-3联合检测能提高PTC尤其是滤泡型甲状腺乳头状癌（follicular variant of papillary carcinoma，FVPC）的正确诊断率。HBME-1与其他肿瘤标志物联合应用，可有助于PTC的鉴别诊断。

（五）细胞角蛋白19

细胞角蛋白 19（cytokerantin-19，CK-19）为低分子量角蛋白，广泛存在于单层上皮细胞，是复层上皮细胞的较小组成部分，如基底细胞层。CK-19在正常甲状腺滤泡中为局灶性表达，而在PTC中呈弥漫性强阳性表达。有研究认为CK-19阳性表达并不是恶性肿瘤的特异性染色，但对乳头状增生和乳头状癌有鉴别作用。由于CK-19在一些良性甲状腺肿瘤或炎性甲状腺结节中也有表达，所以其单独作为甲状腺癌的肿瘤标志物的特异性不高；但由于其在甲状腺癌细胞中表达的高度敏感性，因此CK-19联合其他肿瘤标志物的敏感性及特异性得到提高，对甲状腺癌的诊断有很大意义。

（六）基质金属蛋白酶

基质金属蛋白酶（matrix metdloproteinases，MMPs）是由多种锌离子依赖性酶组成的酶系家族，参与结缔组织的降解和重建、炎症反应、肿瘤扩散转移等。这些酶及其特殊抑制剂通过促进细胞外基质降解在肿瘤的进展及转移过程中起着重要作用。现有报道发现MMPs与甲状腺肿瘤转移有一定关系。

（七）其他

除上述生物标志物以外，其他如 VEGF、hTERT、β-catenin、cathepsin等相关的分子标志物也值得关注。已经发现的与甲状腺癌相关的分子标志物众多，但目前尚未发现针对甲状腺癌完全特异性的标志物。

二、基因多态性

肿瘤的发生和演进是一个典型的多因素、多基因、多阶段的复杂过程，是遗传与环境因素相互作用的结果。其中，遗传因素是由不同基因、不同基因多态性的组合效应构成的，为此需要对众多基因的多态性与肿瘤相关性进行分析。目前，单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）作为人类基因组最常见的多态性表现形式，不仅可以作为遗传标记，通过连锁分析可定位疾病基因，而且有些SNP本身就可直接导致疾病的发生。鉴定甲状腺癌易感基因，不仅有利于深入了解甲状腺癌的发病机制，也能为甲状腺癌的风险预测、早期预防以及新药的筛选提供理论依据和生物靶标。

（一）DNA损伤修复相关基因多态性

DNA损伤修复基因泛指那些编码产物在功能上参与DNA损伤识别和修复的基因，这类基因的突变会使损伤DNA得不到及时有效的修复，或发生错误修复，积累至一定程度就可导致细胞死亡或癌变。DNA修复相关基因多态性导致的DNA修复效率与保真度的差异与个体肿瘤发病风险之间有密切关系。

近年来，针对DNA损伤修复基因的研究逐渐增多，但是涉及与甲状腺癌易感性相关的DNA损伤修复基因的不多。DNA损伤修复基因SNP与甲状腺癌易感性关联研究汇总如下所示（表5-2-1）。

X线修复交叉互补基因（X-ray repair cross-complementing gene 1，XRCC1）参与 DNA断裂修复及碱基切除修复途径中的核心成分。XRCC1基因编码的蛋白质通过与多聚ADP核糖聚合酶（PARP）、DNA连接酶Ⅲ（LigⅢ）及DNA多聚酶B（Pol B）的相互作用，参与DNA碱基修复及DNA单链断裂修复，后者是细胞内DNA 受内外环境致癌因子包括离子化放射、氧应激等作用最常见的受损形式。该基因3处常见的单碱基突变分别为第6外显子第194密码子C→T转换、第9外显子第280密码子G→A转换、第10外显子第399密码子发生G→A转换，分别致编码的氨基酸发生Arg→Trp、Arg→His、Arg→Gln替换反应，最终使XRCC1编码的蛋白质功能发生变化，使机体对癌症的易感性发生变化。

人类X线交错互补修复基因3（X-ray repair cross-complementing gene 3，XRCC3）定位于人类染色体 14q32.3，其编码的XRCC3蛋白是重要的双链修复因子，XRCC3蛋白作用于同源性重组，该途径对于防止染色体断裂、易位和缺失有重要作用，染色体的这些变异可导致肿瘤的发生。XRCC3基因在第241个密码子存在多态性，导致苏氨酸由蛋氨酸所取代，经基氨基酸转换为硫亚甲基氨基酸，氨基酸的取代可能影响酶的功能及其与参与DNA损伤修复的其他蛋白的相互作用，因而可能与肿瘤的易感性有关。

（二）代谢酶及其基因多态性

亚甲基四氢叶酸还原酶（methylene tetra hydrofolate reductase，MTHFR），是叶酸代谢的限速酶，在叶酸代谢以及DNA甲基化和DNA合成修复的过程中发挥了重要作用，具有高度多态性，其最常见的SNP位点是C677T（rs1801133）。C677T多态性可降低MTHFR酶活性及血清中叶酸水平，促进DNA甲基化，参与肿瘤的发生发展过程。

针对肿瘤相关的代谢酶及其基因多态性的研究逐渐增多，但是涉及与甲状腺癌易感性与代谢酶及其基因多态性的报道仅见于MTHFR基因。MTHFR基因SNP与甲状腺癌易感性关联研究汇总如下所示（表5-2-2）。

（三）抑癌基因的多态性

肿瘤抑制基因TP53编码一个关键的细胞成分，该成分既可以通过控制细胞周期为DNA修复提供时间，也可以通过诱导细胞凋亡的方式来维持基因组稳定性。TP53（Arg72Pro）是常见的SNP，能下降诱导凋亡的能力，同时和人类很多肿瘤易感性相关。Arg72Pro位于TP53第四号外显子的第72个密码子上，处于编码多聚脯氨酸结构域的片段即末端反式激活结构域和结合区域之间。在人群中，通常有CCC和CGC两种编码序列，分别编码了精氨酸（Arg）和脯氨酸（Pro）。该位点的等位基因Arg被Pro替换后，导致与TP53的结合能力减弱从而削减对线粒体的定位能力，在细胞水平上降低了引导凋亡的能力，增加了细胞周期停滞在G1期的能力。

针对抑癌基因多态性与肿瘤易感性的研究逐渐增多，但是涉及与甲状腺癌易感性相关的抑癌基因多态性的研究不多，TP53基因多态性是报道较多的。TP53基因SNP与甲状腺癌易感性关联研究汇总如下所示（表5-2-3）。

（四）其他

全基因组关联研究（genome-wide association studie，GWAS）是运用高密度生物芯片，对全基因组范围内上百万个SNP进行筛检，比较病例和对照之间的频率差异，再通过大样本量的验证，从而获得全基因组范围内与疾病或性状最显著相关的基因或变异位点的研究方法。GWAS研究摒弃了以往候选基因方法中的人为预先假设，而是在全基因组范围内全面系统地进行筛查，同时采用大样本量（上千甚至上万个病例和对照）和严格的统计学检验水准，获得阳性结果后还要进行多中心的独立样本验证，因此研究结果比较可靠。

自2005年美国《科学》杂志第一篇GWAS研究发表以来，各种复杂疾病如糖尿病、冠心病，以及肺癌、乳腺癌等多种肿瘤的GWAS成果陆续在国际权威期刊上发表。现阶段，无论是GWAS的技术手段还是分析策略都已十分成熟，而这些全基因组关联研究结果中涌现出的大量新的肿瘤易感基因与染色体区域也证明，这一研究策略的实施为人类了解肿瘤遗传致病机制作出了贡献。表5-2-4总结了现有的以甲状腺癌为研究对象的GWAS研究。

三、基因突变

近年来，随着分子生物学研究的不断深入，相关基因与甲状腺癌发生、发展和转归的关系也逐渐成为研究热点，并取得了很大进展。这些研究成果对于更好地理解甲状腺癌的生物学特性、病理诊断、预后推断以及临床治疗都有着重要的实用价值。

目前已经确定B-RAF癌基因（BRAF）、ras癌基因（RAS）、RET/PTC重排基因（RET/PTC）和特异性结合域转录因子/过氧化物酶体增殖物激活受体融合基因（PAX8-PPARγ）为编码各种受体酪氨酸激酶的癌基因，这4个不同基因的改变与甲状腺癌的诊断和治疗关系密切，其他包括p53、HIF-1α、Wnt/β -catenin、microRNA、NF-κB、PI3K等相关基因与甲状腺癌的关系正在研究当中（关于基因突变与甲状腺癌之间关系详见本书相关章节）。

相关基因突变以及多基因联合作用是甲状腺癌形成及发展的重要危险因素之一。检测BRAF基因、RET基因以及TERT启动子基因等可作为甲状腺癌诊断以及预后判断的生物学标记，而TP53基因以及Pax8-PPARγ融合基因等将为抗癌药物的研究提供新的靶点。这些基因将对甲状腺癌的诊断、预后判断以及治疗产生十分深远的影响，因此甲状腺癌相关基因的研究前景广阔。

四、其他（表观遗传学）标志物

表观遗传学（epigenetics）是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传学具有可遗传性、可逆性和DNA序列不变的特征。随着后基因组时代到来，表观遗传学已成为阐明基因组功能的研究热点之一。表观遗传学研究的主要内容包括：DNA甲基化作用、非编码RNA、组蛋白修饰作用等。近年来关于甲状腺癌的遗传学和表观遗传学研究逐渐增多，基因突变和甲基化改变在甲状腺癌发生、发展过程中发挥重要作用。

（一）DNA甲基化

DNA甲基化（DNA methylation）是一种重要的表观遗传学的改变，启动子CpG岛的甲基化改变具有调控基因表达、维持染色体完整性和调节DNA重组等作用。DNA甲基化在染色体完整性的维护、基因表达的调控和重组DNA某些环节的调节等方面有重要的生物学作用。肿瘤发生的一个重要原因是抑癌基因启动子区甲基化导致的基因失活，在转录水平上抑制基因表达。DNA甲基化是恶性肿瘤发生中的一种常见改变，反映了环境因素与遗传因素的相互作用。

在甲状腺肿瘤细胞中研究较多的主要有丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路、磷脂酰肌醇3激酶/丝/苏氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol 3 kinase/serine/threonine protein kinase，PI3K/Akt）通路、促甲状腺激素受体/环磷酸腺苷（thyroid stimulating hormone receptor/cyclic adenosine monophosphate，TSHR/cAMP）通路和 Wnt/β连环蛋白（Wnt/β-catenin）通路，许多基因的遗传学改变或表观遗传学改变会激活或抑制这些通路，进而促使肿瘤发生。

随着对甲状腺肿瘤DNA异常甲基化认识的逐步深入，DNA甲基化检测可作为甲状腺肿瘤早期诊断、疗效预测、抗肿瘤药物筛选等分子生物标志。加之表观遗传修饰可逆性的特点使其成为潜在的疾病治疗靶点。甲状腺癌相关的DNA甲基化的应用主要在以下三个方面：①通过多种甲基化标志物检测进行甲状腺肿瘤的早期诊断，基因的联合检测可以极大地提高肿瘤的阳性检测率。②甲基化抑制剂针对的不是特定的基因而是整个基因组，通过同时恢复多个抑癌基因的表达，降低基因突变的发生率，提高基因组的稳定性，这可能为开发肿瘤药物提供新靶点。③DNA甲基化能直接影响恶性肿瘤的发生发展，并且对预后产生重要的影响，临床病理参数和基因甲基化联合使用可对肿瘤的诊断、预后作出更准确的判断。

（二）非编码RNA

非编码RNA（non-coding RNAs，ncRNA）是指不能翻译为蛋白的功能性RNA分子，分为看家非编码RNA（housekeeping non-coding RNA）和调控非编码RNA（regulatory noncoding RNA），其中具有调控作用的非编码RNA按其大小主要分为两类：短链非编码RNA（包括siRNA、miRNA、piRNA）和长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）。随着越来越多的研究者投身到ncRNA与甲状腺肿瘤研究领域中，发现各类ncRNA作用机制的多样和复杂，目前对甲状腺癌相关的ncRNA主要集中在miRNA和lncRNA。

1.microRNA 微小RNA（microRNA）是一类内源性的、进化上高度保守的非编码单链小RNA，成熟的microRNA可以与特定信使 RNA（mRNA）的 3′端非翻译区（3′-UTR）结合，在转录后水平负性调节基因的表达。研究表明microRNA在许多重要的生物学调控过程中发挥积极作用，如细胞凋亡、分化、增殖等。文献报道，microRNA的表达异常不仅促进了人类多种恶性肿瘤的形成，而且与肿瘤细胞的浸润、侵袭和转移密切相关。

miRNA对于良、恶性甲状腺肿瘤的鉴别诊断具有十分重要的意义，并且其对于甲状腺肿瘤的诊断和预后判断有巨大的潜力（表5-2-5）。虽然大部分甲状腺癌预后良好，但仍有一部分甲状腺癌表现出高侵袭性特征，而且目前对这部分高侵袭性的甲状腺癌在治疗前（如术前）依然缺乏有效的甄别手段，临床处理仍比较棘手。microRNA在特定类型的甲状腺癌中具有相对特异的表达谱，如果在临床上可以借助这些特异性的microRNA来预测高危甲状腺癌的侵袭性行为，并以此来确定更为合理和积极的治疗方案，避免治疗不足和过度，将具有十分重要的医学意义。

2.LncRNA 长链非编码RNA（long noncoding RNAs，lncRNA）是由基因组中非编码序列转录生成的、长度大于200nt、不具有翻译成蛋白质能力的转录本。在很长一段时间，内非编码基因被认为是基因组中的“噪声”和“暗物质”。近年来，大量实验证明由部分基因组中的“暗物质”所转录的长链非编码RNA在表观遗传水平、转录水平、翻译水平、蛋白修饰过程中均可发挥重要的调控作用。

现已发现了数条与甲状腺癌相关的基因lncRNA，包括BANCR、PTCSC3、NAMA、Ak023948（表 5-2-6）。虽然 lncRNA在甲状腺癌中的调控作用渐渐为人所重视起来，但目前对lncRNA与甲状腺癌的认识仍然处于萌芽阶段。lncRNA在甲状腺癌的发生、发展中起着何种重要作用，lncRNA是否影响甲状腺癌的细胞增殖凋亡、侵袭迁移和肿瘤耐药等功能，其能否作为甲状腺肿瘤早期诊断的分子标志以及能否作为靶向治疗的有效靶标，这些都是摆在研究者面前亟待解决的问题。

（三）组蛋白修饰

组蛋白修饰（histone modifications）是指组蛋白的基础氨基末端尾部突出于核小体，常在转录后发生变化，包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等翻译后的修饰，这些修饰构成了丰富的“组蛋白密码”（histone code），能影响染色质的压缩松紧程度，因此在基因表达中起重要的调节作用。

组蛋白修饰除了简单地调控基因表达，更在于它可以招募蛋白复合体，影响下游蛋白，从而参与细胞分裂、细胞凋亡和记忆形成，甚至影响免疫系统和炎症反应等。组蛋白修饰的主要类型包括：组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白磷酸化、组蛋白泛素化和组蛋白SUMO化。

组蛋白修饰研究较广的是组蛋白的乙酰化和去乙酰化。乙酰化修饰位点在组蛋白分子N端赖氨基酸残基上，是一由组蛋白乙酰化酶（histone acetylase，HAT）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacety lase，HDAC）动态调控的可逆过程。正常细胞中HAT与HDAC处于平衡状态，目前已证实组蛋白乙酰化异常与肿瘤的发生、发展有着直接关系，HDACs在多种肿瘤中异常表达。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACIs）是一类有较好抗肿瘤生物活性的化合物，主要是通过组蛋白的乙酰化程度来改变染色质的结构，从而调控基因的表达。它可在体内外诱导甲状腺肿瘤细胞的生长阻滞、分化和凋亡，为甲状腺肿瘤，尤其是失分化甲状腺癌以及甲状腺未分化癌的治疗提供新的思路。由于该类药物具有有效性及有效抑制剂量范围内低毒性的优点，而成为一种具有广泛应用前景的治疗肿瘤的药物。

（钱碧云　张寰）