第二节　干细胞与再生医学的发展历程

人们对于再生的认识和研究实际上是从低等生物损伤器官的发生、发育开始的。发育生物学的研究使人们理解了涉及再生的三种机制：一是损伤部位休眠细胞被激活；二是部分残留在损伤部位的干细胞参与修复过程；三是部分已分化的细胞在创面环境下通过去分化转变为干细胞或干细胞样细胞。随着对发育生物学更深入的研究，人们期望在组织、器官修复方面能像低等生物一样再生出外观和功能完全相同的新的组织、器官。

一、干细胞的发展历程

20世纪初就有科学家提出“干细胞”这个概念，然而直到1963年，才由加拿大研究员恩尼斯特·莫科洛克和詹姆士·堤尔首次通过实验证实了干细胞的存在。他们发现小鼠的骨髓中存在可以重建整个造血系统的原始细胞，即造血干细胞。从发现造血干细胞开始，至今干细胞的发展经历的主要事件如下：

1968年，Edwards和Bavister在体外获得了第一个人卵子。

20世纪70年代，EC细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。培养的干细胞作为胚胎发育研究的模型，虽然其染色体的数目属于异常。

1978年，第一个试管婴儿，Louise Brown在英国诞生。

1981年，Evan、Kaufman和Martin从小鼠胚泡内细胞群成功分离出小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）。他们建立了小鼠ESC体外培养条件。由这些细胞产生的细胞系有正常的二倍体，像原生殖细胞一样产生三个胚层的衍生物，再将ESC注入小鼠体内，能形成畸胎瘤。

1984～1988年，Andrews等人从人睾丸畸胎瘤细胞系Tera-2中产生出多能的、可鉴定的（克隆细胞，称之为胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells，EC细胞）。克隆的人EC细胞在视黄酸的作用下分化形成神经元样细胞和其他类型的细胞。

1989年，Pera等分离了一个人胚胎癌细胞系，此细胞系能产生出三个胚层的组织。这些细胞是非整倍体的（比正常细胞染色体多或少），他们在体外的分化潜能是有限的。

1994年，通过体外受精和患者捐献的人胚泡处于2-原核期。胚泡内细胞群在培养中得以保存其周边有滋养层细胞聚集，ES样细胞位于中央。

1998年，美国有两个小组分别培养出了人的多能干细胞（pluripotent stem cells）。James A.Thomson在Wisconsin大学领导的研究小组从人胚胎组织中培养出了干细胞株。他们使用的方法是:人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取inner cell mass细胞，建立细胞株。经测试这些细胞株的细胞表面标记和酶活性，证实它们就是多能干细胞。用这种方法，每个胚胎可取得15～20个干细胞用于细胞培养。John D.Gearhart在Johns Hopkins大学领导的另一个研究小组，也从人胚胎组织中建立了干细胞株。他们的方法是:从受精后5～9周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞（primordial germ cell）。由此培养的细胞株，证实具有多能干细胞的特征。

2000年，由Pera、Trounson和Bongso领导的新加坡和澳大利亚科学家从治疗不育症的夫妇捐赠的胚泡内细胞群中分离得到人ESC，这些细胞体外增殖，保持正常的核型，自发分化形成来源于三个胚层的体细胞系，将其注入免疫缺陷小鼠体内产生畸胎瘤。

2003年，中国科学家建立了人类皮肤细胞与兔子卵细胞种间融合的方法，为人胚胎干细胞研究提供了新的途径。

2004年，Massachusetts Advanced Cell Technology报道克隆小鼠的干细胞可以通过形成心肌细胞修复心衰小鼠的心肌损伤。这种克隆细胞比来源于骨髓的成体干细胞修复作用更快、更有效，可以取代40%的瘢痕组织和恢复心肌功能。这是首次显示克隆干细胞在活体动物体内修复受损组织。

2006年，Takahashi和Yamanaka用逆转录病毒将四种转录因子（Oct4，Sox2，Klf4，cMyc）转入小鼠真皮成纤维细胞获得具有ESC特征的多潜能干细胞。这些细胞被命名为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS 细胞）。

2007年，美国Whitehead研究所Jaenisch研究组重复并改进了Yamanaka的iPS工作。他们建立的小鼠iPSC不仅在体外培养条件下可以无限扩增和分化为体内的任何种类细胞，并且在注入囊胚后参与嵌合体的发育和生殖细胞的形成。

2012年，由于用逆转录病毒将四种转录因子（Oct4，Sox2，Klf4，cMyc）转入小鼠真皮成纤维细胞获得具有ESC特征的多潜能干细胞。因此，日本的Yamanaka与英国的Gordon共同获得诺贝尔生理学或医学奖。

2013年，美国哥伦比亚大学医学研究中心的科学家首次成功地将人体干细胞转化成了功能性的肺细胞和呼吸道细胞，大大地推动了再生医学的发展。

我国对干细胞技术领域的研究非常重视，《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020）》中明确提出，“基于干细胞的人体组织工程技术”将成为未来15年中国前沿技术的重点研究领域，包括干细胞临床基础研究、植物细胞全能性与器官发生等方面的研究，尤其在伦理学方面中国对干细胞技术的研究有很好的支持度，中国目前在干细胞的基础性研究、移植和脐带血临床应用方面，处于世界上的相对领先地位，并发挥着重要作用。目前，正在广泛开展的试验性干细胞治疗疾病有脊髓损伤、脑卒中、大脑损伤和大脑性麻痹等，使得干细胞研究成为中国与世界各国最为接近的研究领域和产业发展。

目前，干细胞技术的应用，在药物研发、疾病治疗和再生医学等领域的潜力得到了国际高度重视，掀起了干细胞研究新的热潮。

二、再生医学的发展历程

再生是一个既古老又崭新的课题。在中国汉代时就普遍使用地黄治疗出血和接续断骨，《本草拾遗》《神农本草经》和《治百病方》等都记载有对以冷兵器损伤为代表的组织损伤起修复作用的药物或验方。历史上，再生生物学起源于对创伤修复和附属物再生的观察。由于争斗和意外事故，一些损伤如穿透伤、多发性骨折、脊髓压迫，或眼伤贯穿人类历史。旧石器时代的洞穴壁上发现的断指手印成为发现创伤的重要证据。早期人类已经注意到了各种创伤它们有的是长期存在的而有的则不是，并试图用基本的方式促进修复。那时，他们也可能已经意识到再生的现象了，如观察到动物如甲壳类和鹿能够分别再生出腿和鹿角、树木周期性地更新其叶子和种子，这些现象也有助于人们对再生的认知和好奇心。

几千年来，无论人们的知识水平如何，在治疗方法用以促进创伤修复之前，创伤修复实际上也是能够完成的。促进创伤愈合的方法，包括外科介入是古代苏美尔人、埃及人、中国人、印度人和印加人医学中最主要的内容。在古代文化中，创伤的清洗和清创是惯例，许多不同的植物和矿物质混合物用来处理创伤。古代中国人和埃及人用蜂蜜和酒做抗菌剂，中国人使用发面霉菌治疗轻微烧伤已超过2000年。在治疗头部创伤时，印加人用穿颅术降低颅内压。一千年以前，印度医生苏胥如塔使用自体皮肤移植来重建被切割的鼻子和耳朵。

希腊和罗马医生希波克拉底（公元前460年—公元前370年）、色勒俗（公元前25年—公元50年）、伽林（130—201），对医学的发展，包括创伤治疗，贡献很大。伽林职业生涯的一部分时间用来照顾受伤的角斗士，因此，对于身体各部位的创伤治疗经验都很丰富。伽林参与编译了那个时代的几乎所有我们知道的解剖学、生理学和医学治疗书籍，至少35卷。在公元5世纪结束之际，罗马帝国瓦解，伽林的教材被译成东罗马帝国的医学语言阿拉伯语，之后又被译成拉丁语。直到中世纪结束，这些教材都是医学实践的主要指导。

14～17世纪，生物医学创造性的繁荣是基于更多的结构和功能上更精确详细的观察而建立的。主要贡献是达芬奇（1452—1519）、维萨里（1514—1564）、帕拉萨尔苏斯（1493—1541）、皮奥（1523—1562）、法布里修斯（1537—1614）对胚胎和成体结构的解剖学描述。笛卡尔（1596—1650）和伯雷利（1608—1679）编写了生理学的重要教材，哈维（1578—1657）出品了关于血液循环和动物繁殖的重要论著。外科医生查鲁里克（1300—1370）于1363年出版了《创伤与骨折》，这本书详细说明了多种创伤及其治疗方法。威廉法布里（1560—1634）论述了近70种治疗创伤的应用构想，其中很多种经再次检查后发现有真实的治疗价值。

17世纪的近代科学发起了技术和概念上的革命。2个世纪前发明的印刷术传播了更多新的结果和想法，技术革命是化学实验的开始，推动了望远镜、显微镜的发展。概念革命始于对亚里士多德天体运动观点的挑战。开普勒（1571—1630）表明行星运动在椭圆轨道上，每条轨道所需的时间与它们到太阳的距离是成比例的。伽利略（1564—1630）精确地证明了哥白尼一个世纪前的推断:地球环绕太阳轨道运行，而不是教条的宗教时间观点。牛顿（1642—1727）三大运动定律中相关的力和运动学现在已被称为牛顿力学。笛卡尔（1596—1650）将这些物理和数学关系概括为哲学机制——物质界的万物，包括生物体，都可以被视为根据严格的数学物理定律行动的机器。1687年，牛顿发表了他的自然哲学的数学原理，正式提出了理性指导科学研究的四条规则:①求自然事物之原因时，除了真的及解释现象上必不可少的以外，不当再增加其他；②在可能的状况下，对于同类的结果，必须给以相同的原因；③物体之属性，倘不能减少，亦不能使之增强者，而且为一切物体所共有，则必须视之为一切物体所共有之属性；④在实验物理学内，由现象经归纳而推得的定理，倘非有相反的假设存在，则必须视之为精确的或近于真的，如是，在没有发现其他现象，将其修正或容许例外之前，恒当如此视之。

这些规则提供了强有力的方式回答了事物如何工作的问题，改变了我们之前认为世界是永恒的观点。

17世纪早期，复式显微镜的发明使得对生物结构的观察比以前更详细，能更好地理解自然界的生物现象。这一技术跳跃式地向前发展引领了18世纪显微解剖学的科学发展。比较解剖学家约翰·亨特（1728—1793）研究皮肤创伤修复时发现了肉芽组织及其在瘢痕组织形成中的过渡作用。预先形成的教条认为个体发生的机制是微小的成体在鸡蛋中生长，C.F.Wolff对鸡胚的研究推翻了这一观点，C.F.Wolff表明胚胎发育被一系列的无定形物质表观遗传学调控。

19世纪有了更多的医学和外科手术学进展，改善了对严重创伤和疾病恢复的预期。乙醚麻醉的发展使无痛外科手术成为可能，因此，当人体处于不同治疗情况时增加了外科手术干预的类型，然而外科手术也会增加系统性全身感染而引起死亡的可能性。约瑟夫·李斯特是巴斯德的一个学生，引进了石炭酸浸湿辅料的使用和严格的医院卫生检查，以对抗外科术后的败血症。19世纪外科医生恢复了几个世纪前苏胥如塔提出的皮肤移植术。

19世纪对未来生物学和医学最重要的发展是唯物论生物学的崛起，是笛卡尔哲学机制的结果。直到18世纪中期，人们认为生物特性是由于非物质的生命力，而不是物质化学和物理力调控无生命的物体的属性。然而，18世纪下半叶由拉瓦锡（1743—1794）开始，进入19世纪后由其他人继续的实验表明生命依赖于实验室里可再生的化学反应。随着施莱登和施沃恩（1838～1839）细胞理论的形成，以及后来魏尔萧、瑞麦克和其他人的显微观察，对生长和繁殖的解释更清晰，细胞是实现生命化学反应的基本单位，新的细胞是由已存在的细胞分裂产生的。

到了20世纪，生物和医学知识出现了空前的爆发性发展。主要进展是抗体的发现和生产，疾病的分子置换治疗的发展，对免疫系统的了解揭示了自我和非自我抗原的差异性，以及高度复杂的成像系统和外科手术技术的发展。这些进展，加上工程学和材料科学的进展，免疫抑制药物的发展，使我们能够通过组织器官移植和仿生设备的植入，进行输血、置换受损和功能障碍的组织器官等操作。

毫无疑问，20世纪生物学最根本最深远的事件，是在世纪中叶发现DNA是遗传物质。DNA结构解释了遗传物质如何复制和突变，信息如何编码蛋白质结构并表达，推动了生物学的发展，使我们对细胞的了解呈指数级增加。

在中世纪虽然有大量人的断臂和断腿的再生，以及古希腊神话中已提到的水螅再生的报道。但是，直到18世纪，再生才成为系统科学研究的焦点。亚伯拉罕完成了水螅再生的全部实验，雷奥米尔和斯帕兰扎尼分别观察到了甲壳类和蝾螈的再生。19世纪末20世纪初肢体发育和再生的研究对理解发育做出了重要的贡献。在20世纪之前，两栖动物和甲壳类的肢体再生被解释成进化论。推测这些动物的肢体包含多个预制附件的副本，其生长受截肢的刺激。在20世纪初期，再生被认为是一个调整过程，将剩余部分修复成全部。Thomas Hunt Morgan（1866—1945）转向遗传学之前，他的主要研究目的是用化学和物理原理解释再生。一个世纪之后，人们仍在致力于上述解释，同时实现由来已久的梦想——能够再生组织和器官。现在，在21世纪的第二个10年，生命科学跨学科研究的飞速发展及化学和信息学使这个目标触手可及。

三、现代再生医学的三个重要发展阶段

第一个阶段源于1981年小鼠胚胎干细胞系和胚胎生殖细胞系建系的成功（这项成果直接导致了基因敲除技术的产生），这是再生医学理论的诞生。

第二个阶段始于1998年美国科学家Thomson等人成功地培养出世界上第一株人类胚胎干细胞系，从此，在全球范围内，科学家希望将胚胎干细胞定向分化，以构建一个丰富的健康组织库用来替代一些被疾病损伤及老化的组织或器官，以达到治疗与康复的效果，这是再生医学真正的开始。但是，由于获取胚胎干细胞所带来的伦理等问题一直受到来自多方面的制约，因而，干细胞研究进展有限。

第三个阶段是2006年底日本京都大学Yamanaka和美国科学家Thomson两个研究组分别在Cell与Science上报道，他们利用4种转录因子联合转染人的体细胞成功地诱导出多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC），这意味着科学家们已克服了因伦理而不能采用胚胎干细胞进行细胞治疗的瓶颈，使得再生医学离临床又近了一步。

随着干细胞培养技术的进步，越来越多的成体干细胞能够在体外培养和扩增，而且成体干细胞是组织再生的源泉，对成体干细胞的研究必将进一步推动再生医学的发展。

我国在再生医学研究某些方面已经跨入国际先进行列。付小兵在国际上首先发现损伤修复过程中成熟的皮肤角质细胞去分化之后，在许多成体组织损伤修复中陆续观察到了去分化现象，大大推动了再生机制的研究。他获得的人体汗腺再生成果成功应用于临床，并正在推广应用。另外，我国已经通过组织工程技术，生产出与天然人体皮肤类似的组织工程人工皮、肌腱以及韧带等，并已进行临床应用。