第三节　诱导多能干细胞

长期以来，分化细胞的细胞核是否仍保持着发育多能性一直是科学界关注的研究热点。1962年，英国Gordon实验室利用核移植技术将非洲爪蛙体细胞的细胞核移植到爪蛙去核卵母细胞中，使之发育成一只蝌蚪，证明体细胞的细胞核仍保持发育的多能性；多利羊的诞生证明了哺乳动物的体细胞核同样可以在移植到去核卵母细胞后被重编程；此外，将分化的细胞与ES细胞融合，分化细胞的细胞核可被重编程到ES细胞状态。这些研究表明：分化细胞的细胞核仍保持多能的发育潜力，去核卵母细胞或ES细胞中的成分具有使已经分化的细胞重新回到未分化的状态的能力。但是，这些具有重编程能力的分子是什么却不得而知。研究人员通过各种技术手段，比如小鼠卵母细胞浆蛋白质组学、ES细胞转录组学研究等，希望明确这些具有使分化的细胞核重新逆转到多能状态的分子的身份。

2006年，日本科学家Takahashi和Yamanaka利用逆转录病毒基因表达载体将已知在ES细胞中高表达的4种转录因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，简称OSKM因子）导入胎鼠或成年小鼠的皮肤成纤维体细胞，在体外成功地直接将这些分化的细胞诱导成为类似ES细胞的多能干细胞。这些细胞被命名为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS细胞），它们能在体外培养中无限自我更新并具有自发分化为各种类型的细胞和在体内形成畸胎瘤的能力。这是第一代小鼠iPS细胞，尚无形成嵌合体的能力。2007年，美国Whitehead研究所Jaenisch研究组重复并改进了Yamanaka的iPS细胞工作。他们建立的小鼠iPS细胞不仅在体外培养条件下可以无限扩增和分化为体内的任何种类细胞，并且在注入囊胚后参与嵌合体的发育和生殖细胞的形成。同年，Yamanaka和美国Thomson研究组分别用特定的因子诱导人类成纤维细胞成为iPS细胞。随后，Jaenisch的研究组还利用单核苷酸突变而致的镰刀状贫血小鼠的成纤维细胞建立了疾病iPS细胞，通过基因打靶修正疾病基因。然后，将含有正确基因的iPS细胞诱导分化为血液干细胞并移植回患病小鼠，使小鼠的贫血症状得到改善。这一成果证明iPS细胞具有应用于疾病治疗的潜能。iPS细胞的分离培养成功首次证明可以用几种已知的因子在体外逆转已经分化的细胞，使之成为具有发育多能性的细胞。这种体细胞的直接重编程使我们有可能建立疾病患者特异的iPS细胞，诱导其分化成具有特定功能的细胞用于患者自身疾病的治疗。这些细胞有可能解决异体移植的免疫排斥问题和实现因人而异的药物安全性和毒性检验。疾病患者特异的iPS细胞可用于研究疾病的发生机制和治疗途径；此外，建立iPS细胞系还避开了建立人ES细胞所涉及的伦理争议。因此，这是干细胞研究乃至生命科学领域的重要里程碑。2012年，Yamanaka由于这项贡献与Gordon共同获得诺贝尔生理学或医学奖。iPS细胞研究领域发展迅猛，新的研究成果层出不穷。本节仅就该领域里的关键环节及代表性研究加以介绍。

一、诱导多能干细胞系的建立及鉴定

为建立iPS细胞系，首先需要把重编程因子（一般应用Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc）导入体细胞内。以人的成纤维细胞为例，通常我们用含有编码4个重编程因子序列的病毒感染105成纤维细胞，过夜培养。24小时后，细胞被消化为单细胞并重新铺到用明胶包被并铺有MEF的细胞培养皿。第二天，培养液改为ES细胞培养液。在最初的几天内，细胞形态无明显变化。根据供体细胞状态和病毒滴度的不同，细胞形态的变化始于不同的时间。一般来说，在10天左右，一些被感染的成纤维细胞开始变短，逐渐由长梭形变为多边形，进而圆形。一些变形的细胞开始靠近，集聚成簇。但是，最初开始形态变化的细胞不一定最终会成为iPS细胞。挑选iPS细胞的标准是与ES细胞克隆相似，即细胞体积小、细胞核大、细胞之间紧密靠近的细胞团。通常，将这些细胞团分别挑出，继续扩增。在评估iPS细胞的建立效率时，目前常用的方法是计算Oct4或Nanog表达阳性的iPS细胞克隆数与起始供体细胞的数目之间的比例。有些研究组用碱性磷酸酶阳性的克隆数与起始供体细胞的数目之间的比例来评估。虽然，这一检测方法很方便，但研究证明表达碱性磷酸酶的细胞并不一定是完全重编程（fully reprogramming）的 iPS细胞；它们可能停止在部分重编程的阶段（partially reprogramming）或被称为pre-iPS细胞；它们还可以又回到起始的分化状态。因此，在诱导iPS细胞的培养中含有处于分化或去分化不同阶段的不同形态的细胞。确定挑选什么样的细胞克隆和什么阶段挑选克隆是非常具有挑战性的。ES细胞培养经验和熟悉ES细胞形态特征对建立iPS细胞系非常有帮助。有些研究组利用Oct4或Nanog启动子驱动的EGFP转基因小鼠的体细胞来建立iPS细胞系。这样，当有EGFP表达阳性的细胞集落出现时，就可以挑出继续培养。然而，这种策略并不适用于人iPS细胞系的建立。

iPS细胞具有与ES细胞相似的特点。包括无限的自我更新能力、分化的多能性、保持二倍体核型、能承受反复冻/融等。这些特性与前面介绍的ES细胞基本特性类似。因此，在对新建立的iPS细胞系进行鉴定时，需要检查鉴定ES细胞系的所有指标。此外，还需要检查iPS细胞特有的指标。首先，需要检查外源性重编程因子的表达是否已经被沉默。一般情况下，外源性重编程因子在激活内源性多能性相关因子表达的同时，其自身的表达被抑制，而且在iPSC后续的分化过程中不再被激活。外源性重编程因子的持续表达或再次被激活将影响iPS细胞的分化，也会导致移植后形成肿瘤。另外，由于iPS细胞系的建立过程实质上是外源性重编程因子诱导体细胞发生表观遗传的改变。为了确定表观遗传的变化，最常应用的检验是Oct4或Nanog基因启动子CpG序列中胞嘧啶的甲基化状态。在完全重编程的iPS细胞中，这些区域的胞嘧啶由再分化的体细胞的高甲基化状态变为低甲基化状态。对于雌性小鼠iPS细胞，还可以检查X染色体的灭活。在没有完全重编程的雌性细胞中，有一条X染色体处于灭活状态。与小鼠ES细胞一样，完全重编程的iPS细胞中的两条X染色体都是有活性的。然而，有报道指出人ES细胞中X染色体失活处于一个动态变化的过程。对于人iPS细胞中X染色体的失活情况尚未有明确结论。

2006年Yamanaka研究组建立的第一代小鼠iPS细胞虽然在形态上与小鼠ES细胞相似，能在体外培养中长期自我更新，并具有形成畸胎瘤的能力。但是，它们不具有产生成活嵌合体小鼠的能力。2007年Jaenisch研究组改进建立iPS细胞的技术，它们建立的第二代小鼠iPS细胞不但具有产生嵌合体小鼠的能力，而且具有生殖传递的能力。此外，第二代小鼠iPS细胞在基因表达和表观遗传水平与小鼠ES细胞几乎无任何差别。尽管如此，这些iPS细胞不能像小鼠ES细胞一样在四倍体互补实验中产生存活的小鼠。为了确定小鼠iPS细胞是否与小鼠ES细胞具有相同的发育潜能，我国科学家周琪和高绍荣研究组在进行了大量实验后，于2009年分别成功地利用四倍体互补技术产生了完全由iPS细胞分化和发育而来的小鼠。至此，关于小鼠iPS细胞是否与ES细胞相同的争议终于尘埃落地。但是，对于人iPS细胞是否与人的ES细胞等同却不得而知。虽然最初的研究表明人iPS细胞与人ES细胞高度相似或没有区别，后来的研究发现在基因表达、DNA甲基化、体外分化潜能和畸胎瘤形成能力等方面两者之间都存在佷大的差异。但是，目前尚不清楚这些差异是反映了两种多能细胞类型之间的本质差异，还是源于不同细胞系之间的区别。iPS细胞的遗传背景、重编程因子的表达方式、不同实验室的iPS细胞建立方法和iPS细胞所处的培养代数等都会影响人iPS细胞的基因表达谱式和发育潜能。iPS细胞来源于单个体细胞的重编程，不难想象，供体细胞的不均质、重编程因子导入每个供体细胞效率的不同，基因组插入的位置不同、外源基因表达灭活程度的不同等等都会导致不同iPS细胞系之间在基因表达和发育潜能上不同。所以，对应每种供体细胞需要建立和鉴定多株iPS细胞系，然后根据鉴定结果选择性地保种和扩增3～5株细胞系用于后续的研究。由此可见，有必要开展尽可能多株人ES细胞系和iPS细胞系的研究和比较，从而明确是否这两类人多能干细胞之间的微细区别与它们在疾病治疗中的应用相关。

二、重编程体细胞到诱导多能干细胞

2006年，Takahashi和Yamanaka用逆转录病毒将四种转录因子（Oct4、Sox2、Klf4、cMyc）转入小鼠真皮成纤维细胞获得具有ES细胞特征的多潜能干细胞。1年后，Takahashi等和Yu等利用人类真皮成纤维细胞得到相同的结果。Takahashi等使用四种原基因的组合，Yu等使用Oct4、Sox2、Nanog和Lin 28的组合，这两种组合分别被称为OSKM和OSNL。其他实验室很快发表类似的结果。重编程细胞被称为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS细胞）。比较hiPS细胞和hES细胞可发现两者有相似的外形、生长特征、基因图谱、多潜能基因启动子的DNA甲基化状态。小鼠iPS细胞重新激活多潜能基因、灭活雌性的X染色体、上调端粒酶表达、在嵌合胚实验和肌肉注射到SCID小鼠中能分化成三胚层细胞。小鼠iPS细胞在注射到四倍体胚胎的囊胚中后能发育成完整的小鼠。这种技术叫作四倍体囊胚互补，四倍体胚胎是通过融合两个早期卵裂球形成的。这种胚胎发育成滋养层而不是内细胞团，内细胞团由二倍体iPS细胞提供，iPS细胞在再生医学中的潜能马上被人化的小鼠镰形细胞贫血症所证实。小鼠iPS细胞定向分化成造血细胞消除疾病。

利用逆转录病毒载体携带OSKM和OSNL转染成纤维细胞，其重编程效率很低（0.1%），并且过程缓慢，需要2～4周。重编程效率低是由于大部分细胞处于部分重编程状态，特征为染色体不完全修饰、分化特异性转录因子受到抑制。转基因与载体仍融合在基因组中，逆转录病毒载体能导致插入突变，转基因能影响分化潜能甚至引发恶性肿瘤，特别是c-Myc。因此研究者们也在寻找更简单且有效的方法制作iPS细胞，使转录因子的需要量降到最低，减轻对逆转录病毒载体的依赖，通过同步添加一些小分子提高转染效率。

三、诱导多能干细胞的研究方法

如上所述，最初iPS细胞的建立是通过逆转录或慢转录病毒表达载体将特定的因子导入细胞内。这一方法本身有若干缺点：①重编程因子中的c-Myc和Klf4是致癌因子，它们在iPS细胞来源的分化细胞中的再激活会导致肿瘤发生；②病毒序列插入细胞的基因组会干扰重要基因的表达和诱发肿瘤；③体细胞重编程的效率低，且时程长。因此，为了获得可以在临床上应用的iPS细胞系，我们必须优化iPS细胞技术体系。这里，将针对供体细胞的选择、重编程因子选择和组合、小分子化合物的应用及重编程因子导入载体这四个要因素进行讨论（图2-16）。

1.选择合适的体细胞进行重编程

虽然最初的iPS细胞是从成纤维细胞获得，但是目前研究人员已经利用许多不同类型的细胞建立iPS细胞系，包括骨髓基质细胞、肝脏细胞、胃来源细胞、上皮细胞、胰腺细胞、神经祖细胞、黑色素细胞和成熟B淋巴细胞等。不同的细胞类型重编程的效率不一样。比如，与胚胎成纤维细胞0.02%的建系效率比较，应用髓系祖细胞（myeloid progenitors）和造血干细胞获得iPS细胞的效率可以分别达到25%和13%。这种差异可能源于干细胞或祖细胞的基因转录和表观调控特征与多能干细胞更接近。在考虑利用哪种类型细胞建立iPS细胞系时，除考虑建立iPS细胞系的效率外，哪种类型的细胞更方便从患者身体获得也是重要的因素。无痛苦和损伤地获取体细胞更容易被患者接受。目前，已有多个研究组利用外周血来源的细胞建立iPS细胞系。此外，还有研究报道利用尿液含有的细胞进行iPS细胞的诱导。值得一提的是，研究人员利用临床检查废弃的羊水分离所含有的胎儿细胞可以非常高效、快速地建立人的iPS细胞系。这些胎儿细胞来源的iPS细胞系有可能应用于他们成年后自体细胞移植，也可以考虑建立涵盖人群不同组织相容性抗原的iPS细胞库。

2.对重编程因子的选择和组合

Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc已经被证明可以使许多细胞类型和多种种属，包括人、小鼠、大鼠、猪和猴等的细胞发生重编程。此外，Oct4/Sox2/Nanog/Lin28组成的4因子配方也被成功地用来建立人iPS细胞系。为了防止重编程因子中的致癌因子诱发肿瘤，c-Myc和Klf4首先被舍弃。这导致重编程效率的大幅度下降。在探索体细胞重编程所需要的最少因子配方时，人们又发现Sox2不是必需的，而Oct4在多数情况下是不可缺少的因子。德国Scholer研究组仅用Oct4一个因子分别利用小鼠和人的神经祖细胞建立了iPS细胞系。但是，建系效率非常低。Yamanaka研究组用结构与c-Myc非常接近的L-Myc基因代替c-Myc基因，降低了这类iPS细胞的成瘤性。在探索体细胞重编程的机制过程中，人们发现除经典的4个因子外，其他一些转录因子或表观调控因子对iPS细胞系的建立也有重要作用。比如，有研究发现在应用经典4因子的同时，沉默p53、DNMT或增加UTF1、Nanog和Zscan等因子能明显提高iPS细胞建系效率。另外，有研究发现Sox1和Sox3可以替代Sox2；Klf2可以替代Klf4；甚至Oct4也可以被Nr5a2、Essrb或E-cadherin替代。最近的研究表明不需要任何外源性转录因子，只在供体细胞中过表达特定的miRNA就可以建立iPS细胞系。这些研究结果促进了我们对体细胞重编程分子机制的了解，而随着我们对iPS细胞形成过程认识的深入，将会产生更加优化的重编程因子配方。

3.如何将重编程因子导入体细胞

在过去的几年中，针对这一因素的研究最为集中。这主要是因为最初建立iPS细胞时重编程因子是由逆转录病毒载体导入体细胞的，这一载体的应用限制了iPS细胞的进一步应用。逆转录病毒载体介导体细胞重编程的优点是建系效率高于其他方法，而且重编程因子的表达在体细胞转化为多能干细胞后会自动沉默；后一点是体细胞完全重编程的必要条件。但是，逆转录病毒载体只感染处于分裂期的细胞，这就对供体细胞的选择有所限制。慢病毒载体也被用于iPS细胞系的建立。这种载体对于供体细胞所处的细胞周期时相没有选择，可使重编程因子在处于细胞周期所有时相的细胞中表达。但是，慢病毒载体介导的表达一般不会自动沉默，这不利于体细胞的完全重编程。为了克服这一缺点，药物诱导性慢病毒表达载体应运而生。应用这一载体，人们可以在重编程过程中的任何时间开始或终止外源因子的表达。目前，携带这种表达载体的转基因小鼠已被成功地建立。利用这种转基因小鼠的体细胞建立iPS细胞时，一旦加入药物诱导，重编程因子可以在所有供体细胞中均匀表达，使得iPS细胞的建系效率提高100倍。应用这一策略建立的iPS细胞被称为“Secondary iPS细胞”。这样产生的iPS细胞系其所有细胞的基因组中都具有同样的病毒整合位点。高效和均质的重编程特点使得这一策略被广泛地应用于研究体细胞重编程的分子机制。虽然“Secondary iPS细胞”具有诸多优点，但是它们的基因组上还是插入了慢病毒表达载体，而且这种策略也不适合于人iPS细胞系的建立。2008年，美国Hochedlinger研究组利用腺病毒表达载体建立了小鼠肝细胞和皮肤细胞来源的iPS细胞系。腺病毒载体介导的基因表达具有外源基因不插入供体细胞基因组的优点，从而避免了逆转录和慢病毒载体与基因组插入相关的缺点。同时，Yamanaka研究组也报道了他们利用质粒载体建立小鼠iPS细胞系的研究结果。至今，已有多种非基因组插入表达载体被用于建立iPS细胞系，包括转座子载体、附加载体（episomal vectors），和利用含有多个因子串联在一个DNA载体上的多顺反子载体（multicistronic construct）进行同源重组。其中，有些策略是先用DNA插入的载体建立iPS细胞系，之后再切除外源基因，如piggyBac转座子系统。理论上，这些利用非基因组整合载体建立的iPS细胞中应该不含有插入的外源基因，但是实际上难以完全排除有外源基因插入基因组的可能性。此外，与基因组插入型载体介导的体细胞重编程相比，非基因组插入型载体介导的重编程效率非常低。鉴于这两种类型介导重编程因子表达载体的缺点，研究人员尝试直接将重编程因子的蛋白质导入体细胞诱导多能性。2009年，美国丁盛研究组发表了他们利用在体外表达的与具有跨细胞膜功能的11个精氨酸多肽融合的重编程因子建立小鼠iPS细胞系的工作。同年，美国Kim研究组利用相似的策略建立了人的iPS细胞系。虽然利用重编程因子蛋白直接重编程体细胞从根本上解决了外源基因插入iPS细胞基因组的问题，但是，这一策略需要体外表达和纯化重组蛋白质的技能及反复、长时间在细胞培养中添加这些蛋白。而且，蛋白质诱导重编程的效率极其低（0.001%～0.006%），而且所需要的时间非常的长（30～56天），这严重限制了该策略的应用。2010年，Warren等报道了他们利用体外合成的经过修饰的mRNA成功地建立人iPS细胞系的实验结果，实现重编程效率35倍高于病毒载体介导的重编程。因此，实现了高效和安全地建立诱导多能干细胞系。尽管如此，在实际操作上，这一策略还面临诸多挑战，比如，所需试剂昂贵、需反复向供体细胞中导入合成的mRNA等。

最理想的诱导iPS细胞系的方法应该是不使用有致癌危险的因子和能插入基因组的载体，实现单纯应用小分子化合物诱导多能性的建立。这一愿望并不是凭空产生的。美国Melton研究组利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（valproic acid，VPA）可以提高重编程效率100倍，也可以在没有表达外源性Klf4和c-Myc的条件下建立iPS细胞系。进一步的研究表明乙酰化酶抑制剂能够增加组蛋白的乙酰化水平和激活基因转录，模拟了c-Myc的作用。目前，VPA已经被广泛地应用于各种类型细胞的重编程。应用于体细胞重编程的小分子化合物多数在表观遗传调控过程中发挥作用，这也与iPS细胞系建立本身就是表观遗传改变的本质相一致。目前报道的参与建立iPS细胞系的表观遗传调控小分子还有5-azacytidine（DNA甲基化抑制剂）和BIX01294（组蛋白甲基转移酶G9a抑制剂）。此外，一些调控信号通路的小分子化合物也被发现对多能性的诱导有促进作用，比如BayK8644（L-型钙通道激动剂）、CHIR99021（GSK3抑制剂）和 PD0325901（MEK/ERK 抑制剂）。此外，中国裴端卿研究组发现维生素C能提高iPS细胞建系的效率。2013年，北京大学的邓宏魁研究组报道利用7种小分子化合物成功将小鼠成纤维细胞诱导为iPS细胞，CiPS细胞，其诱导效率可达到0.2%。而且，由CiPS细胞产生的小鼠嵌合体比普通iPS细胞产生的嵌合体生存时间更长。CiPS细胞的成功建立为推进iPS细胞的应用作出了重要贡献。目前，尚无小分子化学复合物诱导建立人iPS细胞的报道。目前，应用比较广泛的诱导方法有Episomal附加载体和不与受体细胞基因组整合的Sendai病毒作为载体导入重编程因子。

总而言之，自2006年Yamanaka首次成功地建立iPS细胞起，针对建立iPS细胞系的技术体系的研究成果如雨后春笋般层出不穷。虽然已有的研究表明利用体外表达的重编程因子重组蛋白，或合成的修饰过的mRNA，或附加载体等相对安全的策略可以建立iPS细胞系，但每种策略都含有这样或那样的缺陷。因此，目前将iPS细胞的衍生细胞应用于临床疾病治疗似乎为时过早。但是，利用疾病患者体细胞建立疾病iPS细胞系，进而模拟和研究疾病却有广泛的前景并正在成为现实。

四、iPS细胞形成分子机制的研究

自从2006年iPS技术首次得到证明之后，这个领域取得了巨大的进步和发展。尽管如此，iPS技术仍存在着很多尚未解决的问题。为了更好地利用iPS技术为人类健康事业服务，体细胞重编程分子机制的研究显得十分重要。很多的研究组开始着手在细胞群的层次上研究这个过程潜在的分子机制。他们首先以小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）为材料，诱导其发生体细胞重编程，然后通过一系列的方法检测并分析重编程过程中不同时间点基因转录和表观遗传修饰的变化情况。Wrana领导的研究组通过基因芯片结合RNAi筛选的方法发现整个重编程可以分为三个阶段即起始阶段（initiation），成熟阶段（maturation）和稳定阶段（stabilization）。起始阶段，OSKM表达诱发小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast cells，MEF）迅速发生应答，主要包括MEF特异的基因的表达下调，细胞增殖相关基因的表达上调。另外该小组还与裴端清小组同时发现起始阶段存在一个对于MEF细胞实现重编程十分关键的事件即间充质-上皮转化（mesenchymal-to-epithelial transition，MET）。机制上，他们发现重编程起始阶段，BMP信号通路协同OSKM因子诱导miR-200家族miRNA的表达，从而促进MET过程的发生。该小组进一步通过追踪可以形成集落的细胞发现在外源四因子（OSKM）的灭活或者抑制是实现从逐渐成熟阶段向稳定阶段转变所必需的。他们通过比较具有和不具有从成熟阶段转变为稳定阶段能力的集落的表达谱发现，大多数多能性因子并不在从成熟阶段向稳定阶段转化过程中发挥作用。因此，这些研究提示出外源基因灭活所介导的向稳定多能干细胞状态转化过程所需要的调控信号是有别于ES细胞多能状态维持的信号通路的。

Hochedlinger所带领的团队通过对可以形成iPS细胞的中间态细胞群进行基因组水平的分析后，发现在整个体细胞重编程过程中存在着两次大规模的基因表达变化，第一次发生在重编程早期（day 0到day 3），第二次发生在重编程后期（day 9到重编程结束）。与Wrana的团队发现类似，他们发现在重编程早期的第一次大规模基因表达变化中，大量与细胞增殖、代谢、细胞骨架相关的基因表达上调，而与发育相关的基因则表达下调。而且上述变化在大多数的起始细胞均有发生。随后的过渡阶段则涉及到若干早期的多能相关基因逐渐上调和一些发育相关及细胞类型特异的基因短时调控。最后，重编程后期发生的第二次大规模基因表达变化主要涉及胚胎发育和多能干细胞状态维持相关的基因，这些基因的表达上调加速核心多能状态调控网络的建立及稳定的多能状态的获得与维持。与Hochedlinger的工作相呼应，Krijgsveld等利用前者的重编程模型进行了整个重编程过程中定量蛋白组学的分析。他们发现蛋白水平的变化与mRNA水平相似，同样存在两次蛋白组的重置，分别发生在重编程的前三天和最后三天。重编程的早期，大量涉及基因表达、RNA剪切加工、染色质重构、线粒体、代谢、细胞周期及DNA修复相关的蛋白强烈诱导表达，而电子传递系统相关蛋白分子则显著表达下调。相对于上述过程，糖酵解相关酶蛋白的表达则呈现出逐渐增加之势，提示出重编程过程中能量代谢的转变是一个循序渐进的过程。另外，他们还发现与囊泡运输、细胞外基质、细胞黏附和上皮间充质转化相关的蛋白在早期呈现表达下调，而在重编程后期则有所上调。以上基于细胞群的研究提示体细胞重编程是一个多步骤的复杂过程，其中涉及两次大规模的转录组和蛋白组的重置过程。

基于细胞群的研究所获得的知识有助于我们理解在重编程过程中细胞内整体水平的变化情况。但实际上，转录因子介导的重编程过程是一个非常低效的过程，只有很少一部分起始细胞最终可以实现真正意义上的重编程，不同时间点细胞群整体水平的基因表达谱并不能准确地反映出那些少数的可以实现重编程的细胞内的基因表达变化情况。随着近些年来各种单细胞检测技术的出现，单细胞水平的重编程的研究逐渐得以开展。首先，Meissner等利用单细胞实时成像技术观察整个重编程过程中细胞形态的变化。他们发现，同细胞群的研究结果相似，四因子（OSKM）诱导表达后，细胞呈现出快速的应答，主要包括细胞增殖速率的加快及细胞体积的减小，而且这些事件发生在第一次细胞周期内，在所有可以重编程的单细胞中具有相同的动力学过程。Jaenisch实验室利用Fluidigm Biomark和single-molecule mRNA fluriscent in situ hybridization（smmRNA-FISH）技术检测包括细胞增殖、表观修饰、ESC维持信号、多能状态标志物和MEF标志物在内的48个基因的表达变化发现，在外源四因子表达的前6天时间里，不同细胞内，上述48个基因的表达存在很大的差别，这提示出在重编程的早期，OSKM四因子诱导基因表达变化是一个随机的过程，而某些重要的多能性基因被成功诱导表达对后续重编程事件的发生是至关重要的。起始阶段，OSKM所诱导的随机的基因变化涉及细胞增殖、间充质-上皮转化、细胞代谢等过程，尽管这些整体的变化是重编程过程中所必须发生的，但值得注意的是，这些基因的变化并不只是局限在那些可以实现重编程的细胞内。针对单集落来源的细胞群的单细胞分析显示出随机的基因表达阶段是一个十分漫长且变异广泛的过程。虽然具有ESC类似形态的细胞很早就会出现，但它们需要跨越一个限速的瓶颈事件才能完成最终的重编程过程。重编程后期，当重编程的细胞开始表达Nanog后，细胞与细胞之间的变异开始显著减小，提示出细胞进入了更加有层次的阶段，进而实现完整的多能性调控网络的建立。

体细胞重编程分子机制的核心问题是转录因子OSKM是如何将处于分化状态的体细胞转变为具有发育多能性的诱导干细胞的。相关研究结果表明OSKM在整个体细胞重编程过程中发挥着至关重要的作用。重编程过程中发生的第一次转录组的转变主要依靠c-Myc和Klf4来完成，而且这一过程广泛存在于所有细胞内。而第二次转录组重置的过程则需要Oct4，Sox2和Klf4三个因子协同作用来实现，并且这一过程只局限在那些可以完成重编程的细胞内。已有的研究表明OSK在重编程过程中发挥先锋因子的作用。无论是小鼠还是人的成纤维细胞，当诱导因子OSKM导入后，这些因子会立即结合开放的染色质区域，这些区域包括处于激活状态和抑制状态的基因的启动子区域。除此之外，早期阶段O、S、K可以作为先锋因子结合到许多基因的远端调控原件上，上调或者下调相关基因的表达，这些基因主要涉及成纤维细胞特异的基因（包括指示成纤维细胞状态的标志基因如Thy1，Postn和Col5a2，以及间充质细胞标志物，如Snail1，Snail2和Twist），细胞凋亡相关基因如Tp53，细胞增殖及细胞周期相关基因如Cdc20和Cdc25c，代谢相关的基因，如Pfkl和Gpi，以及少数一些可以在重编程早期激活的ES细胞特异的基因，比如Fbxo15、Fgf4和Sall4。另外，OSK还可以作为先锋因子参与基因组范围内的染色质重塑过程，当OSK导入细胞后，可以引起常染色体发生大规模的组蛋白修饰的改变，在涵盖多能性相关基因和发育调控基因启动子和增强子在内的1000多个位点上，都获得了H3K4me2的修饰。然而H3K27me3的修饰并没有发生很大变化，只有在高度H3K4甲基化修饰的位点才被去除。而且上述染色质重塑事件的发生要先于对应位点基因转录的改变。MYC在重编程过程中的作用是什么呢？早期肿瘤细胞和发育过程中的研究证明MYC可以促进细胞增殖相关基因的表达，从而调控细胞的增殖过程。据此，早期人们关于MYC在重编程过程中贡献的理解主要是认为其可以通过增强细胞增殖，促进某些多能相关基因或者miRNA的表达，从而辅助体细胞重编程的发生。而且有证据表明MYC对于重编程的发生是非必需的，即便它对体细胞重编程有很强的促进作用。除此之外，在ES细胞中MYC可以通过增强大量处于激活状态的基因的转录延伸过程进而发挥维持ES细胞多能性的作用。最近两篇文献重新对MYC是如何调控基因转录的进行了详细的研究。他们的结果表明MYC并不是特异地调节某类基因的转录，相反，MYC扮演着基因组范围内一个广泛存在的转录放大基因的角色。因此，关于MYC在重编程过程中的作用的理解，需要进一步调整，MYC参与调节的基因可能并不仅仅局限于细胞增殖相关的基因。当OSK因子连同MYC一同过表达时，OSK首先扮演急先锋的作用以便MYC可以结合到那些不易于接近的染色质区域，与此同时，在其他一些MYC的结合位点，MYC也可以起到增强OSK与染色质结合的作用。随着这些因子持续不断地结合到那些处于失活状态的远端增强子区域，进一步会导致其结合到对应基因的启动子区，而这些启动子区在此过程中已逐渐获得新的H3K4me2修饰，最终会产生的结果就是该基因被转录激活。综上所述，OSK在重编程过程中主要起到抑制体细胞特异的基因表达，激活ES细胞相关基因表达，最终建立可自我维持的多能调控网络的作用。而MYC不仅通过促进细胞增殖起作用，而且还可以通过增强众多下游基因转录的方式调节重编程的发生。

五、诱导性多能干细胞定向分化

像ES细胞，iPS细胞定向分化策略必须包括可以复制胚胎发育关键步骤的过程。这些步骤使用一系列已知的能驱动干细胞或祖细胞定向分化的生长因子、底物、其他因子。使用耳诱导生长因子诱导小鼠iPS细胞而来的耳祖细胞能分化成带纤毛的听觉感官的毛发。使用胚胎内胚层分化和后肠形成所需生长因子诱导人类iPS细胞形成后肠胚层，Spence等并分化成肠组织。以类似的方式可以用iPS细胞得到前肠内胚层。这些成就允许更多定向分化成一系列重要的后肠内胚层细胞如胸腺、甲状旁腺、甲状腺滤泡C细胞、肝细胞类似细胞、中脑多巴胺、脊髓运动神经元、心肌细胞同样也可以用人类iPS细胞得到。

如果使用iPS细胞取代受损组织，需要研究疾病的起源与发展，分析药物毒理学。另外一个很重要的问题是这些细胞如何能确定地分化成我们所需要的细胞类型。这依赖于重编程完成的程度，例如iPS细胞是否与受精后囊胚中获得的ES细胞、SCNT囊胚中获得的ES细胞相同？尽管最初的分析表明成纤维细胞获取的iPS细胞与ES细胞在细胞水平、分子水平、功能水平类似，之后的研究表明，人类iPSC与ESC在转录特征上有差异。两项包括数个实验室的研究表明在标准化条件下细胞生的人类iPS细胞与ES细胞在定向分化上差别很小，iPS细胞与ES细胞在全基因组结构及基因表达上很少有一致的差异，并且iPS细胞分化成运动神经元的效率与ES细胞差不多。一些iPS细胞细胞系类似于ES细胞，在培养过程中逐渐形成染色体异常及拷贝数改变，尽管持续扩增能筛选出染色体拷贝数正常的细胞。

有趣的是，类似于胚细胞再生两栖动物肢体或小鼠趾尖，有报道小鼠iPS细胞保留母细胞的转录记忆，并任意保留X染色体的失活状态，引起对iPS细胞衍生及分化的关注。人类β-细胞形成的iPS细胞保留转录记忆的证据已经得到。这些细胞获得多潜能标志并能分化成三胚层细胞。无论如何，它们在胰岛素、Pax、Mafa基因启动子保留开放的染色体结构，与ES细胞及iPS细胞等位基因相比，在体内及体外分化成胰岛素产生细胞的能力较强。由于携带表观遗传学标记，特定细胞类型产生的iPS细胞成为一种潜在方式用于扩大细胞数量再分化回原细胞类型。

六、诱导性多能干细胞的临床问题

尽管利用外源性多潜能基因重编程体细胞与SCNT获得的多潜能细胞及破坏胚胎相比，减少了免疫排斥及伦理问题，但在临床应用上还需要克服一系列问题，有些与ES细胞类似。最主要的问题是分化效率有必要达到100%，以避免形成恶性畸胎瘤。另一个问题是iPS细胞是否能像ES细胞一样稳定及向多方向分化，不同的细胞系在这方面会有区别，因此每种细胞系都需要严格测试。

iPS细胞的产生包括一系列步骤，从建立及扩增细胞系、分化及扩增前体细胞到测试细胞形成恶性畸胎瘤及恶性肿瘤的能力，这一过程大概需要两年时间，对于恶性脊髓损伤这样的疾病太过漫长。并且iPS细胞产生的成本很高，比患者特异性皮肤移植的费用高很多倍，可能达到＄100 000。利用胎盘和脐带血细胞的细胞核建立同种iPS细胞细胞库更划算，它对大部分人群会最大可能地关闭免疫匹配。最后，我们需要确保使用安全的方式将iPS细胞运送及归巢到受损组织。

七、长期体外培养获得的类似胚胎干细胞

结缔组织、骨髓、一些其他组织来源的细胞经过长期培养可以获得ES细胞特征，所有细胞均是胞核大、胞质少。

Young等和Black报道从几乎所有哺乳动物的结缔组织及损伤皮肤的肉芽组织中分离出上胚层样干细胞（PPELS细胞）。PPELS细胞体积小（直径6μm～8μm）、核质比高，自我更新能力很强，在无血清及缺乏抑制因子如LIF的培养液保持休眠状态。它们的分子表型有些类似于ES细胞，如端粒酶，SSEA-1、3、4和Oct-4的表达。在体外它能够分化成软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞及胰岛细胞。有报道在体内向克隆获得的PPELS细胞中转染LacZ基因能成为心肌、血管、结缔组织的一部分，但是否分化成这些组织的细胞尚不清楚。但这些研究者不能证实纯化的AS细胞能转分化，传说中的改变是否因为准备PPELS细胞时被污染。从小鼠及人类组织获得的中胚层谱系特异性干细胞在分化成骨骼肌、平滑肌、心肌、脂肪、软骨、骨、肌腱、韧带、真皮、内皮、肝细胞等细胞类型时，在分化能力上没有年龄差异。

人类、大鼠、小鼠经过骨髓培养分离出的指定成人多潜能祖细胞（multipotent adult progenitor cell，MAP细胞）经过15或更多代培养。这些细胞是小细胞，表达CD34、CD44、CD45、c-kit、MHCⅠ和MHCⅡ抗原表型，它们在SSEA-Ⅰ、高水平端粒酶、转录因子Oct-4和Rex-1表达中，表现出与ES细胞十分相似的特征，并被报道在嵌合胚实验中，几乎可以分化成任何组织。单独用GFP标记的MAP细胞子代在体外被诱导分化成内皮细胞、肝细胞、神经细胞。

利用维持ESC多潜能性的因子，体细胞已成功重编程为ES细胞类似细胞，称为诱导多潜能干细胞。联合使用Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28，以及小分子丙戊酸能诱导成纤维细胞及其他细胞建立ES细胞的表观遗传学特征。这一过程效率很低并使用病毒载体将基因带入细胞内。最近，技术进一步发展，使用修饰的信使RNA提高这些因子的转染效率。因此，避免了外源DNA的引入。iPS细胞在体外能像ES细胞一样发生定向分化，这些衍生物理论上来说是自体基因不需要证明。一些从退行性疾病患者中获得的iPS细胞对揭示疾病起源的机制并寻找治疗疾病潜在的干预措施非常重要。

八、利用疾病建立诱导性多能细胞系模拟和研究重大疾病

很多人类疾病由于缺乏足够的样本和合适的动物模型得不到充分的研究，导致有效治疗手段的缺乏。iPS细胞系的成功建立为我们研究疾病的发生和探索新的治疗方法开辟了新的途径。患者特异的iPS细胞可以作为疾病模型用来研究主要还是基于iPS细胞所具备的两大特性：一是能够无限地自我更新，从而提供充足的细胞来源；二是可以分化形成人体内所有的细胞类型，用于构建不同的疾病模型，探究相应疾病的发病机制。首先，对于遗传性疾病，获得患者的体细胞后经体外诱导可以得到患者特异的iPS细胞系。这样的iPS细胞携带了该患者全部的基因组信息。基于iPS细胞无限的自我更新能力，通过体外扩增，可以获得无限量的细胞用于疾病发生的研究。同时，iPS细胞具有分化成为体内任何种类细胞的能力。可以诱导患者特异的iPS细胞定向分化为与疾病相关的细胞类型，并与正常人的iPS细胞的分化过程进行比较，以发现该遗传性基因突变导致的细胞水平和分子水平的变化，这就是建立疾病细胞模型的概念。利用这样的细胞模型，我们不仅可以研究致病基因是如何引起疾病的，也可以筛选有效改善细胞异常表型的药物，尤其是可以实现个体化的药物实验。另外，对于已知基因改变的遗传性疾病，可以对患者iPS细胞中的异常基因进行定点修正，使疾病iPS细胞成为正常iPS细胞。这样修正后的iPS细胞经过定向诱导分化成为相关的功能细胞，可以为疾病的细胞治疗提供无限的来源。对于非遗传性疾病，患者的体细胞有部分正常细胞和部分异常细胞。异常细胞可供建立疾病iPS细胞系，建立疾病模型，发现疾病发生机制和有效的治疗手段；同时，正常的体细胞可供建立正常的iPS细胞，这种iPS细胞不仅可以定向分化为疾病治疗所需要的细胞类型，也是研究该患者疾病iPS细胞的最佳对照细胞。因为，疾病iPS细胞和正常iPS细胞来自同一个体，具有基本相同的基因组信息（除疾病所造成的基因异常外）。因此，利用疾病患者的细胞建立疾病iPS细胞系，建立体外研究模型成为目前干细胞研究领域的一个重要方向。目前，成功地建立很多疾病iPS细胞系，比如脊髓-肌肉萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）、肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、Ⅰ型糖尿病（type 1 diabetes）、范科尼贫血（Fanconi anemia）、家族性自主神经功能异常（dysautonomia）、雷特综合征（RETT syndrome）、巴金森氏病（Parkinson’s disease，PD）和阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）等。这里举几个典型的例子。

1.脊髓-肌肉萎缩症

脊髓-肌肉萎缩症是最常见的引起新生儿死亡的遗传性神经系统疾病。该疾病的发生是由于survival motor neuron（SMN）蛋白质缺失，导致脊髓运动神经元变性及肢体和躯干的肌肉萎缩。SMN参与RNA剪切。为什么这样一个与RNA剪切相关的蛋白质的缺失只引起运动神经元的变性，而对其他类型的细胞没有影响？可供研究的患者样本的缺乏严重限制了对SMA的研究和治疗措施的开发。2009年，Allison等人利用一位SMA患儿的皮肤成纤维细胞建立了SMA iPS细胞系，并同时建立了这位患儿母亲的iPS细胞系作为正常对照。SMA iPS细胞具有正常iPS细胞的所有特征。但是，与正常iPS细胞比较，SMA iPS细胞产生的运动神经元表现了疾病表型。这是第一次证明人iPS细胞可以在体外模拟人类遗传性神经系统疾病。2011年，Chang等利用另一位SMA患者的成纤维细胞建立了5株Ⅰ型SMA iPS细胞系。他们发现这些SMA iPS细胞向运动神经元分化的能力降低，并且伴有神经元突出生长的异常。在SMA iPS细胞中表达SMN恢复了其向运动神经元的分化能力，且纠正了突出生长延迟的表型。这些结果表明SMA iPS细胞所表现出的异常表型的确是由SMN蛋白质的缺失所致。深入研究SMA iPS细胞来源的运动神经元的异常将极大地丰富我们对SMA发生机制的认识。而且，这些细胞可以用来开发对SMA的有效治疗策略。

2.阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是最常见的老年神经系统疾病，典型表现为进行性丧失记忆和认知障碍。Presenilin 1（PS1）和Presenilin 2（PS2）基因的突变可引起常染色体-显性早发家族性AD。2011年Yagi等利用携带PS1（A246E）和PS2（N141I）突变的家族性 AD患者的成纤维细胞和逆转录病毒载体介导表达5因子（OCT4/SOX2/KLF4/LIN28/NANOG）建立了AD iPS细胞系。他们发现AD iPS细胞来源的神经元分泌β-42淀粉样物增多，这是PS基因突变的典型分子水平病理特征。此外，AD iPS细胞来源的神经元的β-42淀粉样物的分泌对γ-分泌酶抑制剂非常敏感。2012年，Israel等建立了携带有APP（β-淀粉样物的前体）基因复制突变的2位家族性AD患者和2位散发性AD患者，以及2位年龄相配正常对照人的iPS细胞系，并将这些iPS细胞分化为神经元。iPS细胞来源的神经元在基因表达水平与胎脑相似，能形成功能性突触，并表现出正常的电生理活性。但是，与正常iPS细胞来源的神经元相比，携带APP复制的2位家族性AD患者的iPS细胞来源的神经元和1位散发性AD患者的iPS细胞来源的神经元具有高水平的β-淀粉样物、磷酸化的tau和具有活性的GSK3β。他们还发现这些AD iPS细胞来源的神经元中集聚了大量Rab5阳性的早期内涵体。有趣的是，bβ-分泌酶抑制剂，而不是γ-分泌酶抑制剂，能明显地降低磷酸化tau和活性GSK3β的水平。此外，一位散发性AD患者iPS细胞来源的神经元表现出家族性AD患者iPS细胞来源的神经元的表型，提示常染色体-显性型的家族性AD的发生机制也与散发性AD的发生相关。最近，Kondo等利用非基因插入的附加载体表达重编程因子建立携带有APP基因突变的家族性AD（2名患者）和散发性AD（2名患者）的iPS细胞系。他们发现一位家族性AD患者和一位散发性AD患者的iPS细胞来源的神经元和星形胶质细胞内β-淀粉样物寡聚体增多，导致内质网和氧化应激。而且，二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）处理可以减轻这2位AD患者来源iPS细胞分化得到的神经细胞的应激反应。这些研究都为利用疾病iPS细胞作为模型探索重大疾病的发生机制和筛选新的治疗方案的可行性提供了实验证据。

3.Ⅰ型糖尿病

Ⅰ型糖尿病是由于自身免疫性破坏胰岛细胞所致。导致该疾病的细胞学和分子水平机制尚不清楚。美国哈佛大学Melton研究组利用3个转录因子（OCT4/SOX2/KLF4）将1型糖尿病患者的成纤维细胞诱导成为iPS细胞系，并定向诱导这些iPS细胞分化为能产生胰岛素的细胞。这一研究为应用iPS细胞系建立1型糖尿病研究模型和细胞治疗奠定了基础。最近，Kudva等利用仙台病毒载体（Sendai）建立了1型和2型糖尿病患者细胞来源的iPS细胞系，其中包括一位85岁的2型糖尿病患者的iPS细胞系。这些仙台载体介导建立的iPS细胞系无外源性基因的插入。并且在培养至8～12代时，仙台病毒基因组和抗原也从iPS细胞中消失。这样，仙台病毒载体为建立非基因组插入的iPS细胞提供了新的途径。

4.Klinefelter综合征

Klinefelter综合征是一种性染色体遗传的常见疾病。在患有该疾病的患者中，一些患者所有细胞的核型都是47，XXY，而一些患者是47，XXY与46，XY核型的嵌合体。该综合征在男性不育症患者中占3.1%，是引起原发性睾丸功能减退最常见的先天性疾病。我国金颖研究组建立了四株Klinefelter综合征患者前皮成纤维细胞来源的iPS细胞系。这些细胞具有正常人iPS细胞的所有特征，并具有向生殖细胞分化的能力。通过转录组的分析和比较，他们发现一些在Klinefelter综合征患者iPS细胞中异常表达的基因。进一步的分析说明，这些异常表达的基因编码一些与Klinefelter综合征临床症状相关的分子。这样，Klinefelter综合征iPS细胞可以作为研究该疾病的细胞模型。

此外，利用iPS细胞建立疾病模型在心血管疾病的研究中也发挥了重要作用。比如，离子通道性病变，包括long-QT综合征（LQT1，LQT2，LQT3/Brugada综合征，and LQT8/Timothy综合征），儿茶酚多形性室速（catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia，CPVT），心律失常性右心室发育不良（arrhythmogenic right ventricular dysplasia，ARVD），家族性肥厚型心肌病（familial hypertrophic cardiomyopathy，HCM），以及家族性扩张型心肌病（familial dilated cardiomyopathy，DCM）。患者来源的iPSC模型可以用在临床试验前进一步验证动物实验所得到的潜在药物是否在人类细胞中有作用，从而降低临床实验的工作量以及研究成本。iPSC技术除了可以为药物研发提供有效的工具之外，还可以帮助研究人员模拟疾病的发病过程从而探究其深层次的病理机制，开发出新的诊断工具和药物从而对疾病进行早期干预和个体化的治疗。

总之，疾病iPS细胞在体外培养和分化中表现出相关疾病特异的细胞表型是利用iPS细胞建立疾病模型的第一步，发现疾病发生的分子机制和消除异常表型的有效药物是最终目标。此外，不同iPS细胞系之间的异质性使利用同一患者的多株iPS细胞系建立疾病研究的细胞模型，甚至基因修复等手段确定疾病的表型和药物反应成为必要。有必要指出iPS细胞模拟疾病也有一定的局限性。有些疾病的表型依赖于不同种类的细胞之间的相互作用，有些表型在体内的特定环境下才能表现出来。因此，iPS细胞技术与动物疾病模型的相互结合，将更有利于对特定疾病的研究。

九、诱导多能干细胞研究面临的挑战和应用前景

iPS细胞目前的研究应用于新药开发、神经损伤修复、心肌细胞修复、糖尿病治疗，组织、器官再生或移植等再生医疗（图2-17），但目前iPS细胞植入的遗传因子易破坏细胞的基因或残留于细胞内，可能导致细胞癌变、形成肿瘤等问题。

1.应用iPS细胞研究疾病及发现药物

　再生医学的技术可以直接用于创伤或缺血造成组织损伤的病例。但是，将他们应用于变性疾病造成的组织损伤就是另外一个问题。在大多数病例，在组织再生之前，治疗疾病都是刻不容缓的。诱导多能干细胞或许能够为体外研究多种单基因和复杂疾病的机制提供必需的人模型，这些不可能完全通过动物模型来模拟，诱导多能干细胞也可以筛查有治疗作用的候选药物和毒性物质。退行性疾病的细胞转向黑暗面的中轴分子点是什么？如果能发现这些点，有可能设计出独特的治疗方式以消除疾病进程。

应用hiPS细胞已经产生良好的开端，揭示了退行性疾病的秘密。从患有许多早期和晚期疾病患者的皮肤成纤维细胞提取人iPS细胞（表2-2）。用于建立hiPS细胞的早期发作疾病包括肝脏代谢疾病，哈钦森-吉尔福德早衰（Hutchinson-Gilford progeria），Rett综合征（一种伴X染色体的神经发育紊乱），家族性自主神经异常（FD，一种由IKBKAP基因异常剪切造成的罕见的致命的外周神经病变），LEOPARD综合征（一种常染色体显性紊乱，包含肥厚性心肌病在内的多种发育异常），长Q-T间期综合征（由离子通道异常造成，这导致错误的离子流和致命的心律失常），脊髓性肌萎缩，以及精神分裂症，这有高度遗传的可能性。

这些hiPS细胞定向分化成的神经元或心肌细胞概述了这些疾病的细胞学、生物化学和遗传特点。IGFI和庆大霉素可以部分逆转Rett综合征，将家族性自主神经异常（FD）的细胞暴露于植物激素分裂素中，可以明显降低IKBKAP剪切突变体的形成。三种药物有潜在的治疗作用，能够调节长QT综合征的离子流，包括钙离子通道阻滞剂硝苯地平，钾离子通道开放剂吡那地尔，以及钠离子通道阻滞剂雷诺嗪。来源于精神分裂症患者iPS细胞的神经元高表达精神分裂症高风险基因TCF4，并且神经元之间的连接减少，后者可以被抗精神病药物洛沙平逆转。这些结果清楚地显示了应用iPS细胞衍生物研究与疾病相关的分子学畸变的潜能，以及应用iPS细胞衍生物筛查治疗药物的潜能。而且，比较这些细胞和小鼠突变体模型细胞可以揭示出更多关于如何鉴别人和小鼠模型。

用于制备iPS细胞的晚期疾病是ALS和帕金森病。患有ALS的是一个82岁的女性患者，携带与ALS缓慢形成相关的SOD1突变体（Leu 144 to Phe）。已经从这些iPS细胞分化出运动神经元和神经胶质细胞。来源于帕金森病患者的iPS细胞突变体LRRK2 DNA增加氧化应激反应关键基因和α-突触蛋白的表达，对促使caspase-3诱导凋亡的应激源更加敏感，这表明细胞应激反应通路可以作为治疗靶点。通过比较来源于散在的和家族性的帕金森和ALS病例的神经元和神经胶质细胞，我们可以得知在每一种类别中是否有相同的触发和进展事件。例如，在ALS病例，我们可以测定来源于散在病例iPS细胞分化成的星形细胞是否像家族性病例一样对运动神经元有毒性。

2011年，Soldner等指出应用iPS细胞衍生物分析晚期发作疾病的局限性在于，预料其表型是精细的，而且对大量遗传背景中的变异是敏感的，这样就很难在遗传确定的条件下指导实验。他们发展了锌指核酸酶（ZFN）基因组编辑系统，通过这个系统他们可以在健康的人ES细胞上产生两个与帕金森病有关的突变点，并且校正来源于帕金森患者人iPS细胞的α-突触蛋白突变点。这个系统承诺在迟发疾病细胞实验中会精确地控制引起疾病的遗传学变异，而且，在治疗上可以校正用于移植的特殊患者细胞的遗传突变点。

诱导多能干细胞也可以用于研究其他疾病的干预方式。例如，来源于皮肤成纤维细胞的人iPS细胞能够分化成视网膜细胞。这不仅有可能解析视网膜细胞分化发育过程，还可能用iPS细胞衍生物替代受损的视网膜细胞。而且，来源于患者如斑点退变或视网膜炎iPS细胞的视网膜细胞可以用来研究这些疾病的发展进程，并筛查出逆转或阻止他们的潜在药物。

2.疾病的细胞治疗

除应用于模拟疾病和筛选药物外，iPS细胞的一个重要潜在应用是疾病的细胞治疗，特别是自体细胞移植治疗。2008年，Jaenisch研究组将小鼠iPS细胞诱导分化为神经前体细胞（neural progenitor cells，NPC），并移植到约14天的胚胎小鼠侧脑室。9天后，移植的iPSC-NPC整合到受体胎鼠脑不同部位的皮层中。此外，将诱导分化的多巴胺能神经元移植到帕金森病模型大鼠，4周后可见大鼠的症状得到改善。移植人iPSC来源的心肌细胞，可以观察到啮齿类动物心脏收缩功能在短期内得到了一定程度的恢复与提高。随着技术的不断进步与发展，近年来科学家开始同临床医生开展合作，尝试将基于iPSC技术的细胞替代治疗应用到临床患者身上，并取得了初步的进展。2014年日本眼科学家高桥雅代（Masayo Takahashi）领导的研究小组首次完成了iPS技术在临床上的应用，他们将iPSC诱导分化形成视网膜色素上皮细胞，并将这些细胞移植到了一名70多岁的老年黄斑变性女患者的右眼中，没有出现严重的副作用。这是世界上首例利用iPSC来源的细胞在人类疾病中进行的移植手术。尽管这项临床试验是否会最终获得成功还有待观察，但这项开创性的实验势必会为iPSC技术的临床应用产生深远的影响。

3.iPS细胞自体移植与免疫反应

理论上，iPS细胞衍生细胞用于自体移植时应该不发生免疫反应。但这一推论需要实验证据的支持。2011年，美国科学家Xu研究组将4株多能干细胞系，B6和129/SvJ小鼠来源的ES细胞株及分别由附加载体或逆转录病毒载体诱导B6MEF产生的iPS细胞系（分别命名为EiPS细胞和ViPS细胞），移植到B6小鼠。他们发现B6 ESC在B6小鼠有效形成畸胎瘤，没有引起任何明显的免疫排斥反应；而129/SvJ ES细胞引起快速免疫排斥，没有形成畸胎瘤。令人意外的是，B6 EiPS细胞在B6小鼠体内形成的畸胎瘤含有T细胞侵入，提示这些iPS细胞具有引起免疫排斥的能力。但是，上述研究中应用的是未分化的ES和iPS细胞，而在现实中只有ES或iPS细胞的衍生细胞才会被用于细胞移植。有必要进行更加系统深入的研究以便明确下列问题：①是否由iPS细胞来源的分化细胞在自体细胞移植时会引起宿主的免疫反应？②建立iPSC的策略是否会影响iPS细胞衍生细胞的免疫原性？③上述小鼠iPS细胞在小鼠产生的免疫反应是否同样会发生在人类iPS细胞在人体的移植过程？最近，Boyd和Abe领导的研究组分别发现，不论未分化的iPS细胞还是iPS细胞来源的分化细胞，在同种小鼠移植中不产生明显的免疫反应或产生的微小免疫反应与小鼠ES细胞来源的分化细胞没有区别。后两个研究的结果与Xu研究组的结果不同，支持应用自体iPS细胞的衍生细胞进行自体移植。这些差异可能与不同研究组所应用的iPS细胞系是由不同的重编程因子表达载体建立有关。基于目前的研究结果，为了未来人iPS细胞的临床应用，应该避免利用逆转录病毒载体建立iPS细胞系。而且，有必要利用更多的iPS细胞系及其分化的细胞，更加系统地研究iPS细胞来源细胞进行自体移植的可行性。

4.iPS细胞移植细胞产生肿瘤　除免疫原性外，移植细胞产生肿瘤是实现安全细胞治疗的重大障碍。目前，对于人ES细胞或iPS细胞衍生细胞的移植治疗是在免疫缺陷或免疫抑制的动物进行，所以我们不清楚当患者接受自身iPS细胞衍生细胞移植时会有更大或更小的可能产生肿瘤。一般来讲，如果在iPS细胞衍生细胞中含有残余的iPS细胞，往往会在移植后产生畸胎瘤；如果iPS细胞衍生细胞中有高比例的干、祖细胞，有可能产生某种组织细胞类型特异的肿瘤，如神经瘤或肌肉瘤。因此，高效地诱导iPS细胞向特定细胞类型分化并严格地选择所需细胞类型对于避免细胞移植造成的肿瘤发生是非常重要的。另外一个值得考虑的因素是iPS细胞的重编程程度和基因改变情况。外源性基因灭活不完全或在iPS细胞诱导过程中出现遗传改变会导致更大的成瘤危险。除形成肿瘤的危险外，ES细胞、iPS细胞在体外分化得到的细胞往往不能完全成熟，与胚胎期或新生儿期的细胞更相似。细胞的不成熟可能会影响它们在细胞移植后对疾病的治疗效果。此外，移植后的细胞是否能有效地与宿主细胞整合和发挥正常功能也是不容忽视的问题。目前，常用的细胞移植是单一细胞类型，而多数器官是由多种细胞类型组成的并具有特定组织结构。干细胞移植与组织工程的结合有可能为解决这样的问题提供途径。最近，有三个研究组分别报道，人iPS细胞基因组携带有基因的删除或复制（copy number variations）和点突变。其中一些变化与多能干细胞的体外培养相关，类似的变化也见于人ES细胞；而另一些异常存在于供体细胞；还有一些是在体细胞重编程的过程中产生。在iPS细胞衍生细胞应用于临床之前，需要对iPS细胞进行全基因组的序列、基因表达谱式和表观遗传特性等进行全面的检查，确定哪些遗传和表观遗传的改变会影响iPS细胞衍生细胞在移植治疗中的疗效和安全性，选择安全的iPS细胞的衍生细胞用于临床疾病的治疗。

成功应对以上挑战是基于我们对iPS细胞形成过程的分子基础的了解。至今，大量研究已经对诱导多能性的动态过程和分子调控提供了宝贵的资料。但是，还有许多关键问题有待回答，比如重编程因子是如何启动体细胞内源性与发育多能性相关的分子调控网络？如何避免重编程启动导致的细胞应激反应和基因组不稳定？iPS细胞的衍生细胞进行自体细胞移植是否会引起免疫反应？在解决这些重要问题之前，iPS细胞的衍生细胞还不应该进入临床人类疾病的治疗。但是，利用iPS细胞研究体细胞重编程的分子机制，建立体外疾病研究的细胞模型和研究疾病发生和进行有效药物筛选却是现实可行的。这些研究将会为未来iPS细胞在人类疾病治疗中的应用奠定基础。

（金　颖）