第一节　干细胞概述

干细胞既存在于早期胚胎也存在于成体组织。早期胚胎干细胞具有多向分化潜能，分化产生机体的所有类型细胞。存在于成体的干细胞群，可以分化成一个细胞谱系中的各种干细胞，但不能产生谱系以外的细胞。例如，造血干细胞可以分化成不同类型的血细胞，但不能形成肝细胞。

干细胞是组织器官再生的种子细胞，是建立和实践再生医学的最重要的先决条件（图2-1）。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是目前细胞治疗和组织再生研究最热点的成体干细胞。

干细胞是高等多细胞生物体内具有自我更新及多向分化潜能的未分化或低分化的细胞。自我更新（self renewal）是指干细胞具有“无限”的增殖能力，能够通过对称分裂（symmetric division）和不对称分裂（asymmetric division）方式产生与父代细胞完全相同的子代细胞，以维持该干细胞种群。多向分化潜能（multilineage differentiation）是指干细胞能分化生成不同表型的成熟细胞。如胚胎干细胞可以分化为个体的所有成熟细胞类型（包括来源于外胚层、中胚层和内胚层的各种细胞），在成体各组织器官内几乎都存在干细胞，它们在生物体内终生都具有自我更新能力，但是其多向分化能力较胚胎干细胞弱，只能分化为特定谱系的一种或数种成熟细胞。干细胞的能通过旁分泌作用产生多种活性因子影响其所处的微环境，进而改变其他相邻细胞的生物学特性。

一、干细胞的分类

（一）根据分化潜能分类

按分化潜能的不同，干细胞可以分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞（图2-2）。

1.全能干细胞（totipotent stem cell）

是指能够形成整个机体所有的组织细胞和胚外组织的干细胞，如受精卵和早期胚胎细胞，它们可以分化为个体的所有细胞类型（包括外胚层、中胚层和内胚层来源的细胞）及胎儿附属物（胎盘、脐带和胎膜）。

全能性：是指一个单细胞发展成为一个总的有机体的潜力（如受精卵和4细胞期）。

2.多能干细胞（pluripotent stem cell）

是能够分化形成多种不同细胞类型的干细胞，具有多谱系分化潜能特征。如造血干细胞能分化为单核-巨噬细胞、红细胞、淋巴细胞、血小板等；骨髓间充质干细胞除能分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等中胚层细胞外，还可以分化为表皮细胞、神经干细胞等外胚层及肝细胞、胰岛干细胞等内胚层细胞。

多能性：是指细胞有能力产生体内所有类型的细胞，但不产生有机体发育所需的附属性结构，如胎盘、羊膜和绒毛膜。

3.单能干细胞（unipotent stem cell）

通常指特定谱系的干细胞。细胞分布于成体组织内，并具有产生所属该组织的细胞类型潜能，即为单能干细胞。它们仅产生一种类型的分化细胞，因此，分化能力较弱。如表皮干细胞只能分化成为皮肤表皮的角质形成细胞，心肌干细胞也只能发育为心肌细胞。

单能性：是指一个细胞有能力只产生一种细胞类型的能力。

（二）根据组织来源分类

根据所处的发育阶段和发生学来源的不同，可以将干细胞分为胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）、诱导多能干细胞（iPSC）、成体干细胞（adult stem cell，ASC）和生殖干细胞（germline stem cell，GSC），最近，有研究者还提出了肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）的概念（图2-2）。

二、干细胞的生物学特性

干细胞通过细胞增殖完成自我更新，以维持稳定的干细胞数量。有些组织干细胞（如肝干细胞），虽然长期处于静息状态，但仍然具备强大的自我更新能力。其次，在特定分化信号刺激下，干细胞通过非对称分裂被诱导分化为具备特定功能的组织细胞。在某些组织器官（如胃和肠上皮或骨髓）干细胞较频繁地进行分裂增殖以替代损伤、衰老和死亡细胞；但是，其他一些器官（如胰腺或心脏）的干细胞仅在某些特殊条件下，才能进行分裂增殖。

干细胞的分裂有两种方式。其一是与体细胞相同的对称分裂；其二是独特的非对称分裂。非对称分裂产生的两个子代细胞，其中，一个细胞与父代细胞完全相同，并一直保持干细胞稳定状态，同时还产生过渡放大细胞（transient amplifying cell），然后再由过渡放大细胞经过若干次分裂产生较多的分化细胞。另外一个细胞则通过自我更新分化为特定的成熟细胞。

发育要求细胞定向为不同的命运。然而，对于干细胞，必须有一个机制，以维持干细胞的数目，同时也产生分化。这种机制被称为不对称细胞分裂。

不对称细胞分裂时，产生两个不同命运的子细胞。干细胞不对称分裂时，能产生一个类似其自身的细胞（继续作为干细胞），同时产生的另一个子细胞可进入不同的路径并分化（图2-3）。

关于干细胞非对称分裂的机制，目前尚不明确。有几种机制使干细胞决定是否会发生不对称细胞分裂。机制之一是细胞的极性。极性是早期胚胎稳定的特征，但对于组织干细胞可能是短暂的特征。可能是由于干细胞进入分化程序以后，首先要经过一个短暂的增殖期，产生短暂扩增细胞（transit amplifying cell，TAC）。短暂扩增细胞再经过若干次分裂，最终生成分化细胞。外部信号的传递的过程是由跨膜受体参与的。

当细胞迅速生长并一分为二时，是什么触发了这种分裂？和细胞最终达到的大小有关？还是与细胞生长的时间有关？

最近，美国科研人员揭示细胞分裂与细胞最终的体积和细胞生长的时间都没有关系，它们遵循着特殊的量化原则保证不同大小细胞稳定分布。

细胞如何控制自己的体积并保持体积的稳定分布是生物学悬而未决的基本问题之一。研究负责人之一、加州大学圣地亚哥分校物理与分子生物学副教授萨昆·朱利安说，即使对于大肠埃希菌——可能是目前得到最广泛研究的细菌，也没有人能够回答上面的问题。

为了展开研究，朱利安和他的同事设计出一种微型装置来隔离并操控单个细胞，这种装置可以使他们跟踪数千细菌细胞个体几百代的发展过程。他们在严格保持多种生长条件稳定的情况下，监测了成千上万的大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌的生长和分裂过程。这一实验使他们获得了以往研究之数千倍的样本量，在此基础上，他们进行了前所未有的量化研究。

科研人员通过建设与实验数据相匹配的数学模型发现，细胞生长遵循一种生长定律——按照恒定速率进行指数增长。他们还吃惊地发现，细胞对空间或时间都不“敏感”，它们的分裂遵循着“独特而简单的细胞体积控制量化原则”：不管新生细胞大小如何，每一代都会向群体中增加相同的体积，这种增长原则自动保证了不同体积细胞分布的稳定性。

该研究的意义将不仅仅是找到基本科学问题的谜底。科学家指出，深入了解细胞分裂的触发原因可以让科研人员更好地理解细胞分裂失控而导致癌症的过程。

（一）干细胞具有自我更新能力

胚胎干细胞和某些组织干细胞的增殖能力非常旺盛。尤其是胚胎干细胞的分裂十分活跃。胚胎干细胞能够在体外培养环境中连续增殖一年而仍然保持良好的未分化状态。但是，绝大多数组织干细胞在体外的增殖能力有限，它们在快速增殖以后常进入静止状态，如成人肝干细胞、神经干细胞和心肌干细胞，通常处于静息状态，这种独特的增殖方式与组织干细胞保证整个生命周期中组织的稳态平衡与再生密切相关。

干细胞本身的增殖通常很慢，而组织中的过渡放大细胞分裂速度则相对较快。干细胞的上述增殖特点有利于干细胞对特定的外界信号做出反应，以决定干细胞是进入增殖周期，还是进入特定的分化程序。干细胞缓慢增殖特性，还可以减少基因突变的危险，并使干细胞有更多的时间发现和矫正复制错误。因此，干细胞的作用可能不仅仅是补充和修复受损组织细胞，或许还具有防止体细胞发生自发突变的功能。

为了维持稳定的自我更新，干细胞需要防止分化，促进增殖繁衍，自我更新的机制必须转交给其子细胞。虽然其中保持其全能性的具体机制尚不明确，但对小鼠胚胎干细胞的研究表明，一个转录因子的自组织网络的重要性。这些转录因子在防止分化、促进干细胞增殖中发挥重要作用。有利于这一进程的另一个改变是表观遗传修饰（这种改变不会直接影响细胞的DNA序列）的DNA、组蛋白和染色质结构，以这样一种方式，它改变了转录因子与DNA的结合功能。

1.转录因子

如上所述，转录因子在这一进程中发挥了重要作用。这些转录因子类的蛋白质通过其他效应蛋白激活特定信号通路，导致细胞存活，并促进细胞分裂，使细胞进入细胞周期。有几个转录因子调控并维持干细胞的多能性（图2-4）。

2.表观遗传机制

被诱导分化的干细胞的细胞核与未分化干细胞的细胞核是明显不同的。与分化的细胞相比，未分化干细胞的染色质较为疏松。这使某几个基因在未分化的干细胞低水平表达，使细胞具有多能细胞特征。开放式结构能快速调节，这对于干细胞能够响应机体的需要非常必要。有一组蛋白质是非常重要的，它们通过修饰组蛋白而使基因组沉默，这组蛋白质称为polycomb蛋白质组。这些蛋白质已被证实对维持干细胞特性起关键作用，但其在胚胎干细胞作用机制的具体细节仍不清楚。

（二）干细胞具有多向分化潜能

多潜能性是指一个细胞有能力产生少数几种不同类型的细胞。干细胞经过分化进程逐渐变为具有特殊功能的终末分化细胞，与此同时干细胞的多向分化潜能也逐渐丧失。如囊胚内细胞团的多能胚胎干细胞可以产生多分化潜能的各胚层干细胞，然后胚层干细胞再分化为成熟组织细胞。在上述分化进程中，干细胞的分化谱逐渐“缩窄”，即只能分化成为种类越来越少的功能细胞。日前已经鉴定了一些调控干细胞分化的外源和内源性的信号分子。其中，外源性信号，包括其他细胞产生的化学信号以及干细胞微环境中存在的某些分子；内源性信号主要包括某些重要转录因子。这些调控通过干细胞DNA的表观遗传修饰，关闭或者开启某些重要基因的表达，最终调控干细胞的分化进程。

1.干细胞定向分化

大多数干细胞能产生中间型的祖细胞（也称为短暂增殖细胞），然后产生一种细胞分化簇。造血干细胞逐步分化的过程就是一个很好的例子。这些细胞是多潜能的，但需经过一个逐步的过程，按特定路径定向。第一步，产生两个不同的祖细胞，然后，定向的祖细胞经过多次的细胞分裂，产生特定细胞类型。以这种特殊形式，造血干细胞产生了一种生成淋巴细胞系的祖细胞，另一种是生成髓性细胞系的祖细胞（图2-5）。

2.因基因表达变化，定向是不同步的

关闭了进入其他发育路径的基因表达。这些蛋白质能够激活的基因都是某一发育路径必需的基因，关闭表达的基因则是其他发育路径所必需的。

（三）干细胞具有未分化或低分化特性

干细胞不具备特殊的形态特征。因此，难以用常规的形态学方法加以鉴别。干细胞也不能执行分化细胞的特定功能，如心肌干细胞不具备心肌细胞的收缩功能，造血干细胞也无法像红细胞一样携带氧分子。但是，干细胞尤其是组织干细胞）的重要作用是作为成体组织细胞的储备库，在某些特定条件下，它可以进一步分化为成熟细胞或终末分化细胞，执行特定组织细胞的功能。

（四）干细胞具有旁分泌特性

干细胞能分泌多种活性因子影响其所处的微环境，进一步对其在组织原位的其他细胞产生影响，其也可迁移到其他部位或人为移植到其他组织，在那里对其周边的微环境及其相邻细胞产生影响，改变它们的生物学特性，促进它们的增殖、迁移和分化，最终促进该组织的再生。

三、干细胞微龛

1.控制干细胞增殖和更新的信号尚未明确

现已知细胞外基质的相互作用在这方面发挥重要作用。研究结果显示干细胞表达E-cadherin和β-catenin，以及干细胞与那些支持其呈“干细胞样”的细胞之间的连接必需的细胞黏附分子。最好的例子是造血干细胞，造血干细胞与支持它们的骨髓环境中的某些成骨细胞相连接。已发现经由黏着连接的信号转导通路对造血干细胞的更新和增殖是重要的。造血干细胞与成骨细胞之外的细胞直接接触会发生分化，而与成骨细胞亚群相连接的造血干细胞将维持其干细胞特性（图2-6）。

2.在哺乳动物细胞中，不对称细胞分裂的机制还没有完全阐明

可能会有不同机制导致不同细胞分裂。机制之一可能是依赖于特定的蛋白质被分配到有丝分裂的细胞内的不同区域，以至于产生极轴。只有某些决定细胞命运的分子被分配到两个子细胞之一，才会有助于一个子细胞继续维持干细胞特性，而另一个子细胞发生分化（图2-7）。

四、干细胞应用发展趋势

多能性干细胞提供了一种替代细胞和组织的可再生资源，使治疗多种疾病成为可能。许多慢性病如帕金森症（分泌多巴胺的脑细胞被破坏）；1型糖尿病（胰腺中β细胞被破坏）；阿尔茨海默病（由于大脑中的蛋白质斑块的沉积而导致神经元丢失）；脑卒中（凝血块造成脑组织缺氧）；脊髓损伤（致使骨骼肌麻痹）；其他疾病：如烧伤、心脏病、关节炎和类风湿关节炎，缺失的细胞可以利用干细胞替换。

诱导多能干细胞（iPSC）通过诱导控制多能性的关键基因的表达，被重编程的成体细胞可以进入一个多能状态，在这种情况下，C-myc、Sox2、Oct3/4、Nanog等基因的引入就可以办到。然而，这样的研究尚处于起步阶段，成瘤问题也尚未解决，但iPSC在治疗上述疾病方面具有可能性（图2-8）。

通过治疗性克隆获得具有目的基因的胚胎干细胞，作为科学研究和治疗应用资源，可广泛应用于再生医学、研究人类疾病的模型及药物筛选等研究领域。

干细胞的生物学特性决定了其广泛的应用价值，另一方面干细胞可以在体外培养环境中增殖，经过10余年的研究，已建立了一系列成熟规范的干细胞体外培养体系；另一方面，利用干细胞具有多分化潜能的细胞的特性，在体外培养环境中给予一定的诱导条件，就可以将干细胞定向分化为特定类型细胞，然后，移植到机体相应的病变区域替代原本失去功能的病变组织细胞，以治疗多种疾病，如心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、骨及软骨缺损、老年性痴呆、帕金森病等。由此可见，干细胞具有巨大的研究价值和应用前景。

众所周知，我们通常提到的老年痴呆症又名阿尔茨海默病，是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。据患病率研究显示，美国在2000年的老年痴呆症例数为450万例，年龄每增加5岁，老年痴呆症患者的患病率将上升2倍，也就是说，60岁人群的患病率为1%，而85岁人群的患病率为30%。目前，中国老年痴呆症的患病率已随着年龄的升高呈显著增长趋势：75岁以上达8.26%，80岁以上高达11.4%；老年痴呆的患者女性多于男性，60岁以上妇女患老年痴呆症，通常是相匹配男性的2～3倍。

这么多年来，我国乃至世界的顶尖科学家们一直都在潜心研发和探索治疗阿尔茨海默病的方法和技术，但到目前为止，对产生这种病症的原因，医学界也没有一个绝对权威的说法。大家仅仅是将其归结为受各种因素影响，并不时有研究显示，诸如饮食问题、智商问题都可能产生不良的影响。应该说老年痴呆症到现在仍然是一种仅仅为人们知其然而不知其所以然的神秘病症。

但当“干细胞移植技术”问世后，问题便有了解决的方法，它属于一种细胞生物疗法，最显著的作用就是能再造一种全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官。其治疗是通过采集外周血、骨髓或脐带血，通过专用的干细胞分离液，提取、纯化后得到临床治疗所需要的干细胞；经过静脉注射或介入等方法将干细胞输入老年痴呆症患者体内，利用干细胞具有自我复制和分化的能力来修复老年痴呆症患者体内受损的细胞，使机体功能重建，从而达到治疗疾病的目的。

胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）具有向机体三个胚层细胞分化的能力，经过适当的诱导方法可以形成多种细胞类型，因此，胚胎干细胞被认为是最有潜力应用于细胞替代治疗的资源之一。1998年，Thomson等率先将人工授精后废弃的胚胎进行体外培养，成功地从囊胚中分离出内细胞团，建立了人胚胎干细胞系，这一突破性进展在全世界范围内引起极大反响。从此，针对胚胎干细胞的研究一直是生命科学的热门研究领域。但由于伦理争议、成瘤性、免疫排斥等问题，胚胎干细胞的研究仍停留在机制研究和动物实验阶段。

利用治疗性克隆（therapeutic cloning）技术获得的胚胎干细胞系，不仅具有正常胚胎干细胞自我更新和多分化潜能两大特性，而且与患者的HLA配型完全一致，因此具有极高的临床应用价值。治疗性克隆是指将来源于患者自身的体细胞，通过核移植技术，获得囊胚发育，进而从中分离内细胞团，建立胚胎干细胞系。这种治疗性克隆的可行性，早在2002年就开始在小鼠模型中被证实，然而在灵长类动物中，治疗性克隆仍然处于初期研究阶段。尽管2007年Byrne等建立了桥猴体细胞核移植干细胞系；2008年French等首次报道获得了人体细胞核移植囊胚，但是两者获得的效率都比较低，而且在人体细胞核移植研究中，卵子使用、胚胎破坏等伦理道德争论也一直限制着这项研究的开展。

为了避免人胚胎干细胞和治疗性克隆研究带来的伦理争议，一直以来人们都在努力寻找新的体细胞重编程方法，寄希望于不通过卵子的重编程，而是通过其他一些特异的细胞类型诱导体细胞直接转变成为多能性干细胞。但是，这方面的研究一直或多或少存在某种缺憾，无法获得和胚胎干细胞特性一致的多潜能性细胞。然而，2006年Takahashi等通过从24个转录因子中筛选，最终利用4个转录因子建立了诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）。此后，针对iPSC的研究可谓日新月异，2007年Takahashi等和Yu等分别建立了人诱导多能干细胞系。截至目前，已建立超过8种与疾病相关的人iPSC系，其中包括神经退行性疾病、糖尿病等。同时利用iPSC，模拟细胞替代治疗的可行性已在小鼠中获得证明，然而，以病毒作为载体进行的基因操作仍然会带来潜在的治疗安全性问题。2009年Yu等研究表明，利用非整合型附着体载体（Episomal Vectors）方法获得了人iPSC，在去除附着体后，这种iPSC就成为没有外源DNA的细胞，从而解决了潜在的癌变的风险性问题。尽管这项研究成果可以被认为是iPSC向临床应用迈出的有力一步，但是距离iPSC最终应用于临床还有很多技术性的问题需要解决。

需要注意的是多种疾病的基本原因可能是干细胞异常。化生（metaplasia）是发生在一种组织分化的细胞类型转换到另一种组织分化的细胞类型。常见于肺部疾病（如肺纤维化）和肠道疾病（如肠炎病、克罗恩病）。这可能是由于干细胞，而非终末分化的细胞带来的转换。

实际上，很可能多种癌症是干细胞疾病，特别是不断更新的组织，如血液、消化道和皮肤。只有这些细胞持续足够长的时间来积累致病量的恶性转化的基因改变，才产生癌症。

因此，要注重干细胞疾病方面的研究，全面认识干细胞的功能与疾病的关系，促进干细胞应用的发展。

（庞希宁）