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第四节 人工制备的抗体
研究抗体的分子结构与功能、抗体与抗原的相互作用，以及将抗体应用于临床疾病的诊断、预防及治疗等都对抗体有大量需求。 人工制备抗体是大量获得抗体的有效途径，目前根据制备方法可将人工制备的抗体分为多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三类。
一、多克隆抗体
多克隆抗体（polyclonal antibody）是由针对不同抗原表位的抗体组成的混合物，用抗原异物免疫动物后获得的免疫血清（抗血清）为多克隆抗体。 大多数天然抗原带有多种抗原表位，可刺激体内多个B 细胞克隆产生多种针对不同抗原表位的抗体。 多克隆抗体主要来源于动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群。 多克隆抗体是机体发挥特异性体液免疫效应的关键分子，其特点是来源广泛、制备容易；但由于多克隆抗体是针对不同抗原表位的抗体混合物，而并非针对某一特定表位，其特异性不高、易发生交叉反应，从而应用受限。
二、单克隆抗体
解决多克隆抗体特异性不高的理想方法是制备单一表位特异性抗体，即获得仅针对单一表位的B 细胞克隆，使其在体外扩增并分泌抗体。 然而，B 细胞在体外的寿命较短，也难以培养。 为克服此缺点，1975 年Kohler 和Milstein 采用可产生特异性抗体，但寿命较短的B 细胞与无抗原特异性但长寿命的恶性骨髓瘤细胞融合技术，首次成功制备了单克隆抗体。 融合形成的杂交细胞系称为杂交瘤（hybridoma），其既有骨髓瘤细胞大量扩增和永生的特性，又具有免疫B 细胞合成和分泌特异性抗体的能力。
每个杂交瘤细胞由一个B 细胞融合而成，而每个B 细胞克隆仅识别一种抗原表位，故经筛选和克隆化的杂交瘤细胞仅能合成及分泌一种同源抗体，这种由单一克隆杂交瘤细胞产生的仅识别一种特定抗原表位的同源抗体称为单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）。
单克隆抗体制备的基本原理是：小鼠骨髓瘤细胞在体内外适当条件下可无限增殖，但不能分泌抗体；而抗原免疫后的小鼠脾细胞（含B 细胞）能产生抗体，但在体外不能无限增殖。 将上述骨髓瘤细胞与免疫脾细胞融合后，在HAT 选择培养基（含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶）中培养，未融合的免疫脾细胞因不能在体外长期存活而死亡，未融合的骨髓瘤细胞因其DNA 合成的主要途径被氨基蝶呤阻断，同时又因缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶，不能利用次黄嘌呤完成DNA 的合成过程而死亡。 融合成功的杂交瘤细胞从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶，因此能在HAT 培养基中存活和增殖，它们既保持了骨髓瘤细胞能够在体外长期培养、大量增殖的特性，又继承了免疫B 细胞合成分泌特异性抗体的能力，经筛选和克隆化建株，可获得能够产生某种特异性抗体的杂交瘤细胞，将这种杂交瘤细胞株在体外培养扩增或接种于小鼠腹腔内，则可从细胞培养上清液或腹水中获得单克隆抗体（图3-6）。
图3-6 单克隆抗体制备原理
通过抗原多次免疫小鼠，诱导相应抗原特异性B 细胞克隆增殖。 取该免疫小鼠脾细胞（含浆细胞）与非分泌型小鼠骨髓瘤细胞在聚乙二醇（PEG）的作用下融合为杂交瘤细胞。 经HAT 培养基选择培养，只有融合的杂交瘤细胞才能存活和增殖，其既具有骨髓瘤细胞大量扩增和永生的特性，又具有免疫B 细胞合成分泌特异性抗体的能力。 再经抗原筛选阳性杂交瘤细胞并克隆化建株，获得针对抗原表面单一独特表位的抗体，即单克隆抗体
单克隆抗体结构均一，纯度高，具有高度特异性，几乎不与其他抗原发生交叉反应，而且易于大量制备，因此广泛用于医学、生物学各领域。 例如，①在体外检测某种抗原时，用单克隆抗体代替多克隆抗体，可有效地减少交叉反应，提高实验的特异性和敏感性。 ②将单克隆抗体和凝胶颗粒连接制成亲和层析柱，可用于分离纯化微量抗原；将单克隆抗体吸附在小磁珠表面，可用于分离纯化各种细胞。 ③将针对某种肿瘤抗原的单克隆抗体与抗癌药物或放射性物质偶联，构建生物导弹，可用于肿瘤的辅助治疗。
理论与实践
部分批准上市的抗肿瘤单克隆抗体
三、基因工程抗体
由于单克隆抗体通常为鼠源性，对人而言是异种抗原，临床患者反复应用会导致机体产生人抗鼠抗体，使其效果降低并可能发生超敏反应，其应用受到严重限制。 随着分子生物学技术的发展，目前已有多种不同特异性的基因工程抗体作为药物进入临床使用。 基因工程抗体（genetic engineering antibody）是指应用DNA 重组技术和蛋白质工程技术，在基因水平上对抗体分子进行切割、拼接或修饰，重新组装成新型抗体分子，如人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）、改型抗体（reshaped antibody）、重构抗体（CDR 移植抗体）、抗体融合蛋白、双特异性抗体、小分子抗体及人源抗体等。
1.人-鼠嵌合抗体
抗体分子结合抗原的特异性是由轻链和重链V 区决定的，而鼠源单克隆抗体C 区则作为异源蛋白诱发人抗小鼠抗体反应。 将小鼠单抗的C 区用人源抗体C 区代替而拼接成嵌合抗体，可使其既具有抗原结合特异性，又极大降低鼠单抗的异源性。 方法是从鼠杂交瘤中克隆可变区基因，与人恒定区基因构建载体，并在一定表达系统中表达。
2.改型抗体（CDR 移植抗体）
抗体可变区的CDR 是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性。 将鼠单抗的CDR 移植至人源抗体V 区，替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。
3.双特异性抗体
双特异性抗体又称双功能抗体，即一个抗体分子中的两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原表位。 其设计为抗体分子的一个臂可与靶细胞（如肿瘤细胞）表面抗原结合，而另一个臂可与效应物（药物或效应细胞等）结合，从而将效应物直接导向靶组织细胞，并在局部聚集和发挥效应。
4.单链抗体（ScFV）
用适当的寡核苷酸接头（linker）连接轻链和重链可变区基因，使之表达单一的多肽链，称为单链抗体（single chain fragment variable）。 多肽链能自发折叠成天然构象，保持FV 的特异性和亲和力。
5.单域抗体（single domain antibody）
将抗体重链V 区通过基因工程方法表达，获得仅含VH 片段的抗体。
6.最小识别单位（minimal recognition units，MRU）
仅含可变区中单一CDR 结构，分子量仅为完整抗体的1%左右，但可结合相应抗原。
基因工程抗体尽可能保留了单克隆抗体的主要生物学活性（如特异性结合抗原、结合细胞等），同时又可去除或减少一些不需要的结构（如鼠源单克隆抗体中免疫原性较强、易诱导产生人抗鼠抗体的部分），并可赋予抗体分子以新的生物学功能。 其优点是人源化、均一性强、可工业化生产，但不足之处是其亲和力弱，效价不高。
（徐英萍）