10.钠钙处理蛋白的氧化还原调控

心律失常和心肌收缩功能障碍都源于细胞内钠钙处理障碍。其经典的调控机制包括许多影响钠钙调控的蛋白信号途径，如应激活化的蛋白激酶（PKA、PKC和CaMKⅡ）。当心脏处于疾病状态时，ROS生成增多，一方面激活丝氨酸/苏氨酸激酶，使细胞内钙离子稳态失衡；另一方面通过氧化和激活离子通道和转运蛋白，如电压门控钠通道、Na/K-ATP酶、钠钙交换蛋白、L型钙通道、兰尼碱受体及肌质网钙离子ATP酶，引起钠钙失衡，促进心律失常发生。本文就心律失常与心肌钠钙蛋白的氧化还原调控机制作一简述。

一　心脏的氧化还原系统

心脏的氧化还原系统是由生成ROS的蛋白系统和抗氧化的蛋白系统组成的微妙平衡。

1.心脏的ROS来源和抗氧化能力

心肌细胞ROS的来源包括线粒体、NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶和非耦联的一氧化氮合成酶（图1-10-1）。

生理条件下，线粒体内氧化磷酸化产生的少量超氧化物（O•-2）可以被超氧化物歧化酶（SOD）失活变成H2O2。O•-2由于其高活性只能扩散几个纳米的有限距离，而H2O2的低活性可以允许其到达细胞膜。H2O2自身可被谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和硫氧还蛋白（Trx）系统还原成H2O。谷胱甘肽过氧化物酶大量存在于线粒体和胞质中，其活性需要谷胱甘肽的存在，而谷胱甘肽是胞质内主要的氧化还原缓冲物质。还原型与氧化型谷胱甘肽的比率通常大于10，但在病理条件下会显著降低。当超氧化物增加时，随之大量产生的H2O2使细胞内的抗氧化能力大大削弱，同时也可以产生大量高反应性的OH•-自由基或者过氧化亚硝酸基（ONOO-）。

除了在线粒体可以大量生成超氧化物，在心肌细胞也富有NADPH氧化酶（Nox2和Nox4）表达，产生超氧化物。研究显示，在心脏氧化应激（机械张力、内皮素-1、血管紧张素Ⅱ）的条件下，Nox的活性是增加的，且与线粒体内的ROS产物密切相关。Nox依存的ROS产生在线粒体内能够以ROS诱发的ROS释放的正反馈方式大量扩增。虽然目前Nox4的作用还不太清楚，但越来越多的证据显示Nox4的上调和转运至线粒体内能增加ROS的产生，加重心肌功能障碍和心律失常的发生。但也有研究显示基因敲除Nox能够加重心脏功能障碍的进展，这可能是Nox4在血管形成中有益的作用。

ROS的第三种来源是黄嘌呤氧化酶，在心功能不全时其活性和表达是增加的。此外，还有一氧化氮合成酶（NOS），在氧化应激下结构变得不稳定，产生ROS（NOS的非耦联作用）。这种作用在压力超负荷时影响心脏重构。特别注意的是，内皮性NOS（eNOS）常和L型钙通道共存于细胞膜小凹中，而神经性NOS（nNOS）则和兰尼碱受体2（RyR2）共存于肌质网上。这暗示了NOS在ROS依存性的钙离子处理中扮演着重要的角色。

2.离子通道蛋白的氧化还原调控

ROS氧化半胱氨酸的巯基团（SH-），生成二硫基团，从而影响蛋白的三级结构和四级结构，改变通道蛋白的性状和功能。研究已经显示许多钙调节蛋白在生理或病理条件下受到ROS依存性的氧化而发生功能变化。

二　钠钙调节蛋白的氧化还原调控

ROS的蓄积可以引起细胞内钠钙过载。同时，在心肌氧化应激时，细胞内钠过载会极大地增强线粒体ROS的产生。这种正反馈环极大地增强了ROS所导致的损害。细胞内钠钙的稳态是紧密相关的，改变钠调节蛋白会改变细胞内钠含量，进而改变细胞内钙含量及心肌收缩性。图1-10-2简略显示了ROS对钠钙调节蛋白的影响。

1.电压门控钠通道

心肌钠通道由主孔道亚基（Nav1.5）及调节性亚基组成。Nav1.5包含1个蛋氨酸残基，其能被ROS所氧化，降低钠通道开放。ROS也会降低钠通道的利用度，并延长通道从失活状态恢复的时间，引起钠通道失活曲线负性偏移。但ROS并没有改变钠通道的激活特性。

最近一种新型的钠通道电流（晚钠电流）门控模式越来越受到关注，其由ROS来激活。峰值钠电流只持续极短时间（大约10毫秒），但晚钠电流可以持续数百毫秒。尽管晚钠电流的幅度很小（仅为约峰电流的1%），由于其持续特性，仍可以使相当的钠离子通过这种方式进入细胞内。这表明在病理状况下，晚钠电流也是细胞内钠离子的重要调控者。研究显示ROS可增加细胞内钠离子含量，延长动作电位间期（APD），导致早复极（EADs），这可能与ROS增强晚钠电流有关。

除了ROS直接氧化Nav1.5蛋白外，脂质环境的改变或ROS诱导的PKA、PKC和CaMKⅡ激活都可能与ROS对心脏钠通道调控相关。Nav1.5α亚基可被PKA、PKC及CaMKⅡ磷酸化。CaMKⅡ磷酸化位点在丝氨酸571和516及苏氨酸594，由于磷酸化增强了钠通道失活状态，致使电压依存性失活曲线负向偏移。虽然许多相关的磷酸化位点还不清楚，但已明确的是CaMKⅡ能够增大晚钠电流，使细胞内钠蓄积、APD延长及心律失常发生。其机制可能与上述ROS对钠通道调控作用相关。而且，CaMKⅡ基因剔除小鼠中未观察到ROS所引发的晚钠电流改变，暗示CaMKⅡ可能在钠通道氧化还原调控中的重要地位。

PKA及PKC均能够影响心肌钠通道。Nav1.5的Ⅰ-Ⅱ亚基连接环中有两个丝氨酸残基（丝氨酸526及529）均可以被PKA磷酸化。PKA介导的Nav1.5磷酸化可以加速通道移动至质膜，进而增强峰值钠电流密度，但并不改变通道的失活动力学。PKC也能调控钠通道电流。在PKC被抑制的前提下，H2O2减慢钠通道失活的作用消失。在异源表达系统（大鼠及人Nav1.5），PKC的激活并没有改变钠通道的失活状态，使人置疑PKC在钠通道调控中的作用。目前最统一的认识是，PKC磷酸化心肌钠通道Ⅲ-Ⅳ连接处的丝氨酸1505，减小峰值钠电流密度。尽管PKA和PKC都可以或多或少的影响钠通道电流密度，这主要通过改变细胞膜上功能通道的数目，而不是对钠通道门控属性的调控（如激活及失活的过程）。因此，ROS引起PKA及PKC的激活并不能解释ROS对钠通道门控的调控。更可能的是线粒体产生的ROS（由细胞质NADH衍生）通过PKC途径降低峰值钠电流密度。

2.Na/K-ATP酶

生理状态下，细胞内钠离子很大程度上受NKA调控。兔心室细胞暴露于H2O2后，即使出现因ROS介导的钠电流增强16倍，细胞内钠离子浓度也没有改变，正是由于NKA极大地激活。尽管ROS诱导的细胞内钠离子增加的具体机制还不清楚，但ROS本身就具有强力的NKA抑制能力。除了脂质环境的改变外，也有可能是对NKA的直接氧化作用。因为NKA的β亚基含有一个巯基集团，而这又是催化活性的必需基团。

对NKA的氧化还原调控，除了直接氧化作用外，也可通过PKA及PKC途径。磷酸神经膜（PLM）通过降低NKA与钠的亲和力抑制NKA的活性。PKA或PKC磷酸化PLM，使其催化亚基分离而增强NKA作用。因为ROS的实际作用是抑制NKA的活性，而ROS激活PKA及PKC会导致PLM磷酸化、解离，并增强NKA的功能，这一矛盾的推断暗示PKA和PKC不太可能卷入ROS对NKA的调控。

如果NKA大量失活，将会引起细胞内钠激增。除了钠通道引起钠内流增加，通过增强钠-质子交换机制加速钠内流也是有可能的，但具体的病理机制还未知。细胞内的钠与细胞内的钙紧密相关。心肌钠-钙交换（NCX）的活性是膜电位及钠钙跨膜梯度的功能基础。伴随动作电位时程延长，细胞内的钠增加，这样通过NCX引起钙外流减少（前向模式）和（或）钙内流减少（逆向模式），最终会导致细胞内钙的聚集。事实上，在细胞内的钠增多的状况下，通过NCX的钙内流要多得多。

3.钠-钙交换（NCX）

对心肌NCX而言，不同区域的半胱氨酸残基间的二硫键很可能是维持其功能的重要部分。ROS具有激活NCX的作用，但是其激活效果与ROS的多少和来源并没有表现出一致性。对于Ser/Thr激酶在NCX调控中的作用有很多争论。PKA及PKC的催化基团并不能改变心肌NCX功能，暗示了NCX也许不受激酶的调控。另一方面，有报道表明，NCX的细胞内环可以被PKA及PKC磷酸化，继而增加NCX的活性，这也许是ROS增强NCX的部分原因。在细胞内钠增加的条件下，ROS对NCX刺激引起细胞内钙过载。事实上，在心衰中过表达的NCX增强了ROS介导的细胞损伤。而抑制NCX的药物，可以抑制钙内流，从而减少了ROS介导的钙过载，消除细胞损伤。

4.电压门控L型钙通道

心脏L型钙通道的α1c亚基包含10个以上的半胱氨酸残基，因此能够被氧化还原调控。有报道表明，在异源表达系统（HEK293）或心肌细胞，巯基氧化剂或ROS能够不可逆地减少钙电流（ICa）。但另外一些报道表明，巯基氧化剂或ROS能够增强ICa。矛盾的原因可能是CaMKⅡ、PKA、PKC能够通过磷酸化激活ICa，而这三种激酶又由ROS介导氧化/激活。PKA已经证明可以磷酸化L型钙通道α1c亚基的一些位点，其中包括丝氨酸1928。然而钙电流调控的关键磷酸化位点仍然未知，因为对α1c亚基及附属的β亚基的磷酸化都能增强ICa。因此，ROS能够增大ICa（通过丝氨酸激酶激活），也能减小ICa（直接氧化作用）。这最终的效果依赖于ROS的来源及剂量。另外有报道证明H2O2所引发的钙过载是因为细胞内钙库释放和通过NCX流入所致，并非钙通道激活。ROS对α1c亚基最可能的作用是直接氧化还原调控。

5.兰尼碱受体

心肌兰尼碱受体（RyR）2是由4个亚基组成。每一亚基都含有89个半胱氨酸，其中有21个为游离态。巯基氧化物（如H2O2）至少在每个亚基上氧化7个巯基后才能激活RyR释放钙离子。因为RyR2含有多个调控位点，这些位点可以被磷酸化和（或）与Ca2+、Mga2+、ATP、CaM或者调节蛋白（FKBP12.6）相互作用，因此氧化作用可能与这些调节因子有关。事实上，ROS诱导的RyR Ca2+释放增加机制包括RyR对胞质Ca2+及ATP的敏感性改变，RyR 与triadin（调控RyR对细胞内Ca2+敏感性）的相互作用，干扰FKBP12.6的结合。此外，低浓度ROS能够增加舒张期RyR Ca释放（钙火花频率），而过高浓度的ROS则抑制钙火花频率。因此ROS诱导的RyR的调控与具体的氧化程度有很大关联。

ROS除了能直接氧化RyR半胱氨酸残基外，也能通过激活丝氨酸/苏氨酸激酶来增加RyR Ca的释放。众所周知，RyR2经CaMKⅡ及PKA磷酸化后增加舒张期Ca2+的渗漏。两种激酶都可以通过ROS氧化激活。因此，ROS对RyR2的部分作用很有可能是通过氧化CaMKⅡ及PKA完成的。

舒张期Ca2+渗漏增加的一个后果就是减少了SR Ca2+容量，尤其是在ROS降低肌质网钙离子ATP酶（SERCA）功能的情况下。ROS已经证明可以减少SR Ca2+容量。这会导致暂时性Ca2+缺乏及降低收缩力。由于前向型NCX的快速激活，舒张期Ca2+外流是延迟晚复极的主要因素。这种由ROS引发的Ca2+火花频率的增加与后复极的延迟及心律失常密切相关，尤其是NCX已由ROS增强的状况下。

6.肌质网钙离子ATP酶2a

肌质网钙离子ATP酶2a（SERCA2a）及其抑制型调控蛋白PLN可以受氧化还原调控修饰。SERCA2a含有25个半胱氨酸残基，其中只有1～2个对于酶活性具有关键作用。巯基氧化物或ROS可以抑制心肌SERCA活性，部分原因可能是直接影响其ATP结合位点。此外，CaMKⅡ（苏氨酸17）及PKA（丝氨酸16）可以磷酸化PLN，使PLN解离，激活SERCA。后者可能与ROS依赖的SERCA调控没有太大的关系，因为ROS只显示出抑制SERCA活性的功能，或许这与PKC介导的信号通路相关。与CaMKⅡ及PKA激活SERCA不同，有报道表明PKC降低SERCA的活性。心脏PKAα基因缺陷的小鼠表现为高收缩力，而携带有过度表达PKAα基因的小鼠表现为低收缩力。内在的机制可能与PKAα介导蛋白激酶抑制剂-1（PPI-1）磷酸化有关，PPI-1激活后使PLN脱磷酸化。SERCA2a活性的减少可以导致SR Ca2+容量的减少，并使钙火花幅度降低或消失。

三　ROS相关的心律失常

细胞内钠钙处理蛋白的改变与心电不稳定性密切相关。ROS延长APD，引起EAD的机制，以前研究认为是ROS增大ICa。近年研究显示选择性钠通道阻滞剂TTX可以逆转ROS的这种延长APD的作用，主要是TTX抑制了ROS增强的晚钠电流。最近进一步证实，这种机制与氧化还原激活的CaMKⅡ增强晚钠电流有关，从而延长APD，引起EAD。ROS的来源和含量不同，ROS介导的ICa增加和Ito电流减少在电不稳定中也起着重要作用。

细胞内钙过载和ROS介导的舒张期钙外漏使NCX内向电流增加，使钙离子向细胞外转运，产生去极化电位，引起延迟后除极（DAD）。心肌暴露于ROS后，能显著增加EAD和DAD，这种作用在CaMKⅡ基因敲除的小鼠显著减少。CaMKⅡ缺陷所致的致死性心律失常多为单形性或多形性室速。因此，氧化还原对CaMKⅡ的调控在ROS介导的心律失常中起着重要作用。

除ROS能致使钠钙处理蛋白调控障碍，ROS对线粒体ATP的影响也能增加心律失常的发生。线粒体ROS介导ROS释放使线粒体去极化；同时抑制ATP合成，使胞质KATP通道激活，导致APD缩短，延缓传导。在心脏不同区域，线粒体膜除极时间和空间不一致，易产生折返和致死性心律失常（图1-10-3、图1-10-4）。

综上所述，ROS诱导晚钠电流激活和NKA活性减低，导致细胞内钠积蓄和动作电位延长。这也促进了ROS介导NCX的激活，使钙离子进入细胞内。另一方面，ROS增强了RyR2的开放率，同SERCA功能障碍（肌质网钙重吸收减低）一同引起舒张期钙渗漏增加。肌质网功能障碍并不能代偿由NCX转运至细胞内的钙离子，这样共同显著提高了细胞内钙离子的浓度，减少了SR钙火花，致使心肌收缩性减低、心律失常发生和细胞损伤。

（刘刚　郑明奇）

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