7.钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ

钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）的多重作用使其在心血管事件中的地位举足轻重。特别是其在分子信号通路中作用于下游多个靶点，促进血管疾病、心衰、心肌肥厚和心律失常的发生、发展。深入了解CaMKⅡ的结构与作用机制有助于制订心血管疾病新的治疗策略。

一　CaMKⅡ的分子结构及亚型

1.CaMKⅡ的分子结构

CaMKⅡ是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其催化磷酸化的核心是RXXS/T，R是精氨酸，X代表任何一种氨基酸，S是色氨酸，T是苏氨酸。CaMKⅡ是由一对六聚物环组成的全酶复合物，共12个单体，每个单体由3部分组成，即氨基端的催化区，中间的调控区和C端的链接区（图1-7-1）。催化区包含ATP结合袋，这种微环境仅需很低的能量就可以水解ATP变成ADP，同时将一个磷酸根转至靶蛋白的丝氨酸/苏氨酸上，使靶蛋白磷酸化。链接区（褐色球）将CaMKⅡ单体链接成六聚体全酶，这对于保证整个CaMKⅡ的生理功能是必需的。调控区对于CaMKⅡ的活化方式以及在心血管疾病中的作用举足轻重。

2.亚型及分布

CaMKⅡ广泛存在于肌肉、神经和免疫组织中，目前共有4种亚型，即α、β、γ和δ，它们在不同的组织中分布不同，且在Ca2+/CaM结合的敏感性和激活动力学上也存在细微差别。α、β亚型主要在神经组织中表达，δ亚型主要在心肌表达。在成人心脏中存在两种CaMKⅡδ剪接变异体，即CaMKⅡδB和CaMKⅡδC。其中CaMKⅡδB包含一个有11个氨基酸的核定位序列，这个核定位序列非常容易使CaMKⅡ进入细胞核内，所以CaMKⅡδB主要位于细胞核内，对基因转录活性有重要的作用，如心肌肥厚相关的基因；而CaMKⅡδC亚型则没有这个核定位序列，主要在细胞质内，主要参与调控膜兴奋性和细胞内Ca2+的稳态。

二　CaMKⅡ的激活机制

静息条件下，如低氧化应激或低细胞内Ca2+，CaMKⅡ是失活的，因为催化区被调控区自动抑制不能发生催化作用。CaMKⅡ活化主要有两种方式：

1.Ca2+/CaM依赖性CaMKⅡ激活

这是经典的激活方式，当细胞内Ca2+浓度升高及Ca2+/ CaM形成复合物结合到CaMKⅡ调控区的羧基端（红色），使调控区对催化区的自动抑制作用解除，从而激活CaMKⅡ，催化靶蛋白磷酸化。随着Ca2+/CaM解离，CaMKⅡ失活。

2.另一种是非Ca2+/CaM依赖性CaMKⅡ激活

在氧化应激，包括神经内分泌激素（ISO、NE、AngⅡ或ET1）条件下，即使Ca2+/CaM解离，通过调控区Thr287自身磷酸化和蛋氨酸（Met281/282）氧化，CaMKⅡ也能维持活性。其作用机制：

（1）Ca2+/CaM持续结合于CaMKⅡ，使CaMKⅡ调控区内Thr287位点自身磷酸化。Thr287自身磷酸化提高了CaMKⅡ的活性，主要通过下述两个过程：①Thr287自身磷酸化增加了Ca2+/ CaM对CaMKⅡ的亲和力大约1000倍，此所谓“CaM捕获效应”；②即使Ca2+/CaM解离后，CaMKⅡ的Thr287磷酸化形式仍然留有酶学活性，因为Thr287磷酸化阻断了调控区和催化区的再联系以及调控区对催化区的自动抑制。Thr287自动磷酸化程度决定于Ca2+/CaM的刺激频率和细胞内钙火花的期间，Ca2+/CaM的刺激频率越高（心动过速时）和细胞内钙火花的期间越长（心衰的致心律失常电重构或LQT综合征），Thr287自动磷酸化程度就越高。此所谓“CaMKⅡ记忆功能”。

（2）在氧化应激环境下，特别是心脏疾病时，氧化应激能够通过直接和间接方式增强CaMKⅡ活性：①氧化应激能够使磷酸酶失活，从而增加Thr287自动磷酸化活化的CaMKⅡ的数量；②心脏CaMKⅡδ亚型的Met281/282氧化阻断了催化区和自动抑制区的再联系，即使在没有Ca2+/CaM结合的条件下，产生了类似Thr287自动磷酸化的翻译后修饰能力，使CaMKⅡ激活。同时氧化应激也能够增强Ca2+/CaM依赖CaMKⅡ活化的敏感性。

所以，CaMKⅡ自动磷酸化和氧化应激通过翻译后修饰的方式维持CaMKⅡ活性，使CaMKⅡ从Ca2+/CaM依赖性酶转换为Ca2+/钙调素非依赖性酶，这在心血管疾病，特别是心律失常中起着重要的作用。

三　CaMKⅡ对靶蛋白的调控作用

CaMKⅡ的生理功能是将细胞内Ca2+和氧化应激效果传递到下游靶蛋白，如心肌离子通道和兴奋收缩耦联相关的蛋白，促进血管疾病、心衰、心肌肥厚，特别是心律失常的发生、发展（图1-7-2）。CaMKⅡ能磷酸化多种钙调蛋白，包括L型钙通道、兰尼碱受体（RyR2）和受磷蛋白（PLN）。另外，CaMKⅡ磷酸化心肌钠通道，增加晚钠电流，延长动作电位间期（APD），产生早后除极（EAD）。

1.CaMKⅡ对离子通道蛋白的调控作用

（1）钙通道：

心室肌细胞T管胞膜凹陷处富含持续激活的L型钙通道，其紧邻肌质网（SR）的兰尼碱Ca2+释放通道，从而极易激活兰尼碱表面的受体（RyR）使SR中大量Ca2+释放入胞质，产生兴奋收缩耦联。

CaMKⅡ能够催化磷酸化L型钙通道的α亚基Ser1512和Ser1570位点，以及β2a亚基的Thr498位点，进入具有高开放比率和延长开放时间的2型活化，增加峰钙电流且失活减慢。这种CaMKⅡ的易化作用不仅通过L型Ca2+通道增加大量Ca2+内流和触发SR钙释放，并且能通过正反馈环进一步提高CaMKⅡ的活性。众所周知，动作电位平台期阻抗极高，而L型钙通道电流作为平台期很重要的组成部分，即使钙电流轻微增大，也极易发生EAD，所以CaMKⅡ增加L型钙通道电流被认为容易产生EAD和SR钙渗漏，钠钙交换电流（INCX）和延迟后除极（DAD）使动作电位延长，特别是QT间期延长，产生致死性心律失常（LQT综合征和TdP）。CaMKⅡ对L型钙通道的致心律失常作用与β亚基Thr498磷酸化增强相关，因为消除Thr498位点抑制通道的2型活化显著降低了EAD的发生率。同时，Thr498位点磷酸化引起细胞内钙超载，产生细胞死亡，这种重构作用与窦房结功能障碍和电折返相关（图1-7-3）。

（2）钠通道：

Nav1.5作为心肌中主要的钠通道，其电流（INa）内向流动是心房肌和心室肌细胞膜兴奋的基础。INa由较大的峰钠电流（形成动作电位的上升肢）和较小的晚钠电流（动作电位的平台期）组成。现已明确Nav 1.5是CaMKⅡ的重要作用靶点，因为Nav 1.5与Cav1.2的α亚基有结构相同的4个区域，特别是在Ⅰ和Ⅱ区域的细胞内连接含有CaMKⅡ的磷酸化位点Thr571，暗示了CaMKⅡ同样能够磷酸化Nav1.5的α亚基。其作用机制为：①CaMKⅡ在快频率刺激时减少峰钠通道的利用度，使QRS间期延长；②CaMKⅡ增加晚钠通道电流，延长动作电位平台期，以及增加细胞内钠负载，从而减低钠钙交换体的效率，造成细胞内钙超载，引起后除极。晚钠电流增加是心衰和LQT综合征发生心律失常的机制。心衰时细胞内钠离子浓度升高，促使ROS生成增多，也可以潜在激活CaMKⅡ的活性。研究显示，CaMKⅡ激活和ROS能增强峰钠电流和晚钠电流，而使用CaMKⅡ抑制剂KN-93或晚钠通道阻断剂雷诺嗪均能减少EAD，抑制心律失常的发生。峰钠电流减少可能产生类似于Brugada综合征的心电图改变，而晚钠电流增强反映了氧化应激、心衰、LQT3时的INa变化，暗示了CaMKⅡ对Nav1.5有常见的致心律失常作用。总之，CaMKⅡ能够磷酸化Nav1.5，而ROS增强INa的作用至少一部分是由于对CaMKⅡ的激活。同时蛋氨酸的氧化能够改变Nav1.5的门控模式，暗示了氧化应激对INa的影响也可能是CaMKⅡ非依赖模式激活。

（3）钾通道：

CaMKⅡ对心肌钾电流作用比较复杂，因为心肌细胞膜有多种钾通道。CaMKⅡ影响钾电流的机制包括对通道蛋白磷酸化、对SR Ca2+的影响、转录调控和减少通道蛋白向胞膜位移。ROS对钾电流的作用机制在某些方面可能与CaMKⅡ的作用机制相重叠。抑制CaMKⅡ可以增强缺血预适应，降低由缺血再灌注引起的细胞死亡，其中机制至少部分是由于胞膜KATP表达增加，而没有改变KATP的门控属性。H2O2刺激引起的心室肌IKATP增加能被CaMKⅡ抑制剂KN-93逆转，暗示CaMKⅡ氧化能够调控IKATP。但由于氧化过程十分复杂，CaMKⅡ可能仅参与其部分过程。

钾电流是心肌复极重要的决定成分。CaMKⅡ对动作电位复极的影响至少部分上是由于其对钾电流的作用。在心肌细胞，抑制CaMKⅡ可显著增加峰钙电流，但是常表现为动作电位缩短，主要还是由于CaMKⅡ使快速复极的钾电流（Ito，f）和内向整流钾电流（IK1）增加。这表明CaMKⅡ影响复极与细胞内钙稳态紧密相连，因为上述Ito，f和IK1的上调能随PLN的抑制而回复至基线水平。而且CaMKⅡ介导的Ito，f和IK1增加并不是由于转录增加或者钾通道蛋白表达量的增加引起的。

另一方面，CaMKⅡδ的过表达可以使动作电位复极延长和Ito，If、Kv4.2和KCHIP2下调，伴随着Ito、和Kv1.4的表达增加。所以，CaMKⅡ对钾通道是多方面调控，包括通道位移、门控属性的改变和转录水平的调控。但是ROS如何通过CaMKⅡ途径对钾通道调控尚不清楚。

2.CaMKⅡ对非离子通道蛋白的调控作用

CaMKⅡ对于维持细胞内钙稳态十分重要，特别是通过对肌质网兰尼碱受体（RyR）和肌质网Ca2+ATP酶（SERCA2a）的调控，使肌质网Ca2+释放和重吸收，完成兴奋收缩耦联（ECC）。

（1）兰尼碱受体：

作为肌质网Ca2+释放通道，兰尼碱受体与T管上的L型钙通道相距很近，这样十分有利于通过L型钙通道流入细胞内，引起Ca2+诱发的肌质网内大量Ca2+释放。这一过程主要是通过Ca2+激发CaMKⅡ活化，从而使RyR磷酸化完成。研究显示，CaMKⅡ至少能直接磷酸化RyR Ser2814位点，在舒张期和ECC时激活RyR门控通道，释放Ca2+。所以，在心脏疾病状态下，CaMKⅡ的表达和活性增加，增强了RyR磷酸化，引起舒张期钙渗漏。由之而来的NCX内向除极电流增加诱发延迟后除极（DAD），多见于儿茶酚胺多形性室速（CPVT）。基因修饰动物模型也证实了CaMKⅡ介导的RyR改变是心衰和心律失常发生的中间介质。CaMKⅡ和H2O2都可以增加RyR2通道开放率，导致钙渗漏增加。

（2）SERCA2a和PLN：

舒张期胞质内大量Ca2+主要通过SERCA2a被重摄取进肌质网，这一过程可被受磷蛋白（PLN）抑制。曾有报道显示，SERCA2a是CaMKⅡ的靶点，但是之后的研究并不这么认为。目前普遍的认识是CaMKⅡ磷酸化受磷蛋白（PLN） Thr17位点，磷酸化后的PLN对SERCA2a的抑制作用减弱，相应的SERCA2a活性增强，Ca2+摄取增加。

（3）三磷酸肌醇受体（IP3R）：

与RyR类似，IP3R是细胞内另一种Ca2+释放通道，常被G蛋白耦联的受体和磷脂酶C激活，使三磷酸肌醇（IP3）释放增加，产生类似于RyR效应，触发肌质网中Ca2+的释放。在成年心室肌主要是2型IP3R，常位于核膜内，为核内CaMKⅡ活化提供Ca2+，磷酸化组蛋白去乙酰化酶（HDAC），从而解除对转录因子肌细胞增强因子（MEF2）的抑制。CaMKⅡ磷酸化2型IP3R，抑制通道开放，产生负反馈调节，这可能是CaMKⅡ的抗心律失常方面比较特殊的作用。

3.CaMKⅡ对转录相关的调控作用

CaMKⅡ活化可以激活Ca2+调控的转录因子。在静息状态下，HDAC，特别是HDAC4/5抑制MEF2激活。CaMKⅡ活化使HDAC4/5磷酸化，HDAC对MEF2抑制作用消除，使MEF2活化，蛋白转录增加，这与成体心脏病理性肥大相关。近来研究显示CaMKⅡ活化对钙调神经磷酸酶（CaN）的转录调控，也显示其与心肌肥大密切相关。

四　CaMKⅡ在心血管疾病中的作用

如上所述，各种上游激活因子通过不同途径激活CaMKⅡ，进一步激活相关信号通路，作用于多种下游靶蛋白，促进离子通道电重构、心肌肥厚凋亡等结构重构，诱发心衰和心律失常（图1-7-3）。

1.心肌肥厚

神经内分泌激素NE、PE或ET-1激活Gq/PLC/IP3信号通路，CaMKⅡ活化引起心肌肥厚和相关基因表达增加，导致心肌肥厚。药物抑制CaMKⅡ可以阻止心肌肥厚发生，而CaMKⅡ表达增加能诱导这些胎儿型基因表达。CaMKⅡδB明显增加心肌肥厚和ANF表达。CaMKⅡδB转基因小鼠显示进展性的心肌肥厚；而CaMKⅡδC转基因小鼠由于肥厚和扩张型心肌病出现心衰。两种亚型都可以通过增加MEF2转录启动肥厚基因表达。ISO也可以通过活化CaMKⅡ途径而不是PKA途径诱导胎儿型基因再表达。另一方面，核内CaMKⅡδ激活CaN，使T细胞核核因子（NFAT）去磷酸化后转为入核，与细胞核内转录因子相互作用，活化多种心肌细胞肥大相关基因。

简而言之，CaMKⅡ对心肌特异转录因子表达的调控主要表现在诱导胎儿基因的再表达，使心肌细胞肥大。

2.心衰

心肌细胞凋亡是心衰发生的病理生理机制之一。心肌凋亡的触发因素包括神经激素、机械应激、SR钙超载；抑制CaMKⅡ可显著使心肌凋亡减少。

CaMKⅡ通过线粒体通路激活细胞凋亡。CaMKⅡ诱导细胞凋亡的下游机制并不很明确，但是与促凋亡蛋白酶有关。除了作用于转录后水平，CaMKⅡ在转录水平也调控凋亡通路。CaMKⅡ激活MAPKs促进凋亡。例如，CaMKⅡ直接磷酸化MAPK激酶TAK1和ASK1，激活JNK和p38MAPK。JNK激活c-jun/AP-1通路，上调促凋亡基因表达。在ER应激下游，CaMKⅡγ磷酸化JNK，从而诱导Fas死亡受体。JNK可直接磷酸化p53，诱导凋亡。p38MAPK参与p53介导的细胞死亡。CaMKⅡ也可直接调控p53表达。此外CaMKⅡδ可以激活AP-1转录因子家族，调控AP-1基因转录而不依赖JNK通路。因此，CaMKⅡ可以直接或通过JNK通路调控促凋亡基因转录。

3.心律失常

（1）CaMKⅡ在心律失常发生中的作用机制：

多数心律失常并不是由单一因素导致，而是由多种致心律失常触发因子导致，包括老化、氧化应激、缺血、组织损伤、炎症和系统性疾病。有效安全的抗心律失常策略应该能处理信号通路、心肌肥厚和离子通道之间的复杂关系。CaMKⅡ可以将上游的促心律失常因子如氧化应激，与下游通路如离子通道高反应、细胞内钙稳态失衡、组织损伤和瘢痕形成联系起来。因此，抑制CaMKⅡ为成功有效地抗心律失常带来了希望。

如上所述，CaMKⅡ可作用于多种离子通道，包括钙通道、钾通道、钠通道，导致电生理重构，诱发各种心律失常。此外，CaMKⅡ还可以通过非离子通道途径促进心律失常的发生，包括钙离子稳态、心肌凋亡、细胞外基质改建和炎症。钙离子稳态和心肌凋亡在上文已有所阐述。以下主要阐述细胞外基质改建和炎症。

醛固酮可以氧化激活CaMKⅡ，诱导心肌基质金属蛋白（MMP9）合成。心肌梗死和高醛固酮血症中，心肌MMP9增加心脏破裂的发生率。CaMKⅡ也可以通过促进心肌凋亡加速心肌纤维化。因此，心肌CaMKⅡ可以修饰细胞间基质，导致结构重构，促进心律失常的发生。心肌梗死区周围氧化的CaMKⅡ可能是折返性心律失常发生的机制。鉴于CaMKⅡ对细胞外基质的不利作用，抑制CaMKⅡ可以抑制心肌纤维化，从而防止形成促心律失常的基质。另外，CaMKⅡ通过NF-κB通路激活局部炎症反应诱导肌膜损伤，是连接炎症和心律失常的重要分子。

（2）CaMKⅡ相关的心律失常：

①房颤：Tessier等发现，人类慢性房颤组织中CaMKⅡ表达增加。他们认为，CaMKⅡ增加房颤组织细胞中Ito，缩短不应期和动作电位时间，并影响Ito的活性恢复。两种机制都导致心房兴奋性离散，功能性折返环形成，导致心律失常的发生。动物模型和人类房颤组织中CaMKⅡ活动增强，导致RyR Ser2814过度磷酸化，舒张期SR Ca2+渗漏增加，容易引发房颤。②窦房结功能不全（SND）：由于起搏细胞死亡和代偿性的纤维化，内源性窦房结功能不全（SND）常不可逆。典型的内源性SND较多发生在氧化应激和循环血管紧张素Ⅱ增加的情况下，如老年患者出现的高血压、器质性心脏病和心衰。在经血管紧张素Ⅱ慢性处理诱导的SND鼠模型中，窦房结区域因广泛纤维化和细胞死亡导致细胞丢失，出现窦性停搏，变时性不全。血管紧张素Ⅱ通过NADPH氧化酶信号通路诱导ROS产生，进而激活CaMKⅡ。抑制CaMKⅡ可以预防高危患者发生SND。③器质性心脏病中的室性快速性心律失常：CaMKⅡ过表达触发后除极，引起组织重构，导致折返，增加致命性心律失常的风险。抑制CaMKⅡ可有效预防和减少心律失常。④遗传性快速性心律失常：CaMKⅡ参与许多遗传性心律失常的发生，包括Brugada综合征、长QT综合征（LQTS），尤其是LQTS3和Timothy综合征，以及CPVT。Timothy综合征是一种罕见的LQTS，原因是Cav1.2突变，导致通道无法正常失活，ICa增加，动作电位时间和QT间期延长、致命性心律失常和多系统功能缺陷。动作电位和QT病理性延长是心衰、药物和罕见遗传性长QT心律失常中电重构的突出表现。CaMKⅡ在动作电位平台期作用于Cav1.2，增加通道开放，导致钙电流增加，引起早后除极。抑制CaMKⅡ可以使动作电位时间恢复正常，消除后除极。

（3）CaMKⅡ与抗心律失常治疗：CAST试验中抗心律失常药物出现的致心律失常作用，促使人们寻找更为有效安全的抗心律失常治疗策略，由此促进了抗心律失常器械治疗的发展。尽管ICD并不影响器质性心脏病的病理生理进程，然而双心室起搏的心脏再同步化治疗却可以逆转衰竭心脏的结构重构，其可能机制是抑制CaMKⅡ活化。

CaMKⅡ是心律失常信号分子通路中的重要环节。动物实验模型显示，抑制CaMKⅡ可以抑制心律失常的发生。然而仍需CaMKⅡ抑制药物在临床应用以明确实验中观察到的益处是否可以提高患者的生存率。

五　CaMKⅡ在心血管疾病中的临床意义

综上所述，CaMKⅡ具有多种生理学功能，参与多种基础疾病病理生理过程，涉及心肌肥厚、凋亡、心衰、炎症、氧化还原、细胞内钙稳态、促心律失常电重构，在心血管系统疾病中具有广泛作用。充分认识并明确CaMKⅡ的生理病理作用有助于更好地理解心血管疾病的发生机制，从而开发新的抑制CaMKⅡ的药物，制订新的治疗策略，并应用于临床实践，为心肌病、心衰和心律失常患者的带来新的治疗福音。

（郑明奇　田立）

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