第二节　天然药物化学成分分离、精制的方法与技术

通过提取获得的提取液体积较大，所含成分浓度较低，故分离精制之前常进行浓缩处理，以提高浓度。浓缩可通过蒸发或蒸馏来完成，具体的方法有蒸发、常压蒸馏、减压蒸馏、薄膜蒸发、反渗透法、超滤法等，得到的黏稠物质常被称为浸膏。浓缩过程中应注意尽量避免不必要的损失，防止热敏性成分被破坏。目前，实验室常用的减压蒸馏装置是旋转蒸发仪，如图1-7所示。

分离是根据提取所得混合物中各成分之间理化性质的不同而分开的过程。精制也是分离过程，是把得到的具有一定纯度的化合物进一步分离纯化的过程。分离过程可粗略分为部分分离、组分分离、单体分离三个阶段。

一、系统溶剂分离法

将提取得到的总提取物，选用3～7种不同极性的溶剂，由低极性至高极性分步对总提取物进行提取分离。总提取物中的各种成分在不同极性溶剂中由于溶解度的差异而分离。将总提取物分成若干个部分，是一种常用的部分分离的方法。总提取物常为胶状物，可拌入适量惰性吸附剂如粗硅胶、纤维粉及硅藻土等，低温或自然干燥后粉碎，然后依次用石油醚（或苯）、乙醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和水分步进行抽提，由低极性到高极性分步进行抽提，分成若干部位。此种方法的缺点是操作麻烦、费时并需要大量溶剂，对化学性质不稳定的天然产物应特别注意，尽量避免或减少受热时间长、温度高、强酸强碱等理化性质的影响，以防止有效成分分解、异构化等现象的产生。

二、两相溶剂萃取法

两相溶剂萃取法是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的一种方法。

将两种互不相溶的溶剂振摇后放置，即可分为上下两个界面层。同种溶质在两个界面层浓度的比值可用分配系数表示。此数值在一定温度、压力下为一常数。

分配系数（K）可以用下式表示：

K=cu/cL

式中，cu表示溶质在上相溶剂中的浓度；cL表示溶质在下相溶剂中的浓度。混合物中各成分在两相溶剂系统中的分配系数差异越大，则分离效果越好。分离的难易程度可用分离因子β表示，β越大，分离越容易。

β=KA/KB　（KA>KB）

一般根据被萃取化合物的性质选择萃取剂，应遵循的原则是：萃取溶剂应与原溶剂产生分层，提取物中的有效成分与杂质的分配系数有一定差异。

实验室常用的有机溶剂有石油醚、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等。如果从水提取液中欲分离亲脂性成分，一般多用石油醚、苯、氯仿或乙醚等进行两相萃取；如果是亲脂性较弱的有效成分，则应选用亲脂性弱的有机溶剂，如乙酸乙酯、正丁醇等。例如提取黄酮类成分时，多用乙酸乙酯和水作两相萃取；提取亲水性强的皂苷类成分则多选用正丁醇和水作两相萃取。不过，有机溶剂亲水性强的，与水作两相萃取的效果就不好，因为较多的亲水性杂质也会被萃取出来，对有效成分进一步纯化影响较大。

这是一种常用的简便萃取技术，小量萃取一般在分液漏斗中进行。

操作技术：选择合适的分液漏斗，在活塞上涂好凡士林，安装好玻璃塞，旋转数圈，使密封，然后装入待萃取物和溶剂，装入约占分液漏斗1/3的有机溶剂，盖好塞子，倒转，缓缓振摇2～3min，放置使其自然分层，静置，使两液分开后开启活塞使下层液放出，而上层液从分液漏斗上端倒出，以免污染。

此操作简便，设备简单，实验室常用，在操作中需注意以下几点：

（1）在两相溶剂萃取操作中，水提取液的浓度最好在相对密度1.1～1.2之间，过稀溶剂用量大，过浓萃取不完全，影响操作。一般萃取3～4次即可。

（2）每次溶剂与水提取液应保持一定的比例，第一次萃取时溶剂用量要多一些，一般为水提取液的1/3，以后用量可以少一些，一般为1/4～1/6。

（3）要避免猛烈振摇，以免发生乳化而影响分层。若已形成乳化，可采取一定方法破乳：①可分出乳化层，再用新的溶剂萃取；②将乳化层抽滤；③热敷将乳化层加温使之破坏；④较长时间放置并用玻璃棒不时旋转搅拌；⑤加入适量氯化钠或滴入数滴戊醇也有助于分层。

用简单萃取法进行分离时，可利用各化学成分的性质差异，通过某种方法使其分配系数发生改变，然后用萃取法进行分离。对于碱性、酸性、两性成分的萃取分离，常选用pH梯度萃取法。即利用混合物中各成分的酸（或碱）性强弱不同，相应改变溶剂pH使之相继成盐或游离，改变成分在溶剂系统中的分配系数而与其他成分分离的一种方法。例如分离某种有机溶剂中酸性强弱不同的黄酮苷元，可依次用pH由低到高的碱液萃取，使成盐而达到分离的目的。又如在纯化水提液中的总生物碱时，可改变溶液的pH值，使生物碱游离，再用有机溶剂萃取，与亲水性杂质分离。

逆流连续萃取法是一种连续的两相溶剂萃取法。本方法是利用两种溶剂的密度不同而自然分层，当分散相液滴穿过连续相溶剂时，溶质在两相间发生传质的原理。逆流连续萃取装置如图1-8所示，是用一根或数根萃取管串联制成。管内用小瓷圈或小的不锈钢丝圈填充，以增加两相溶剂萃取时的接触面。将密度小的相液置高位贮存器中，而密度大者则作为固定相置萃取管内，萃取管的数目可根据分配效率的需要来决定选用一根、数根或多根，管内填充小瓷环或小不锈钢丝圈，开启活塞，则高位贮存器中液相在高位压力下流入萃取管，遇瓷圈撞击分散成细滴，增大萃取接触面积，两相溶剂在萃取管内可自然分层。

该法萃取效率较高，克服了分液漏斗多次萃取的麻烦。可取试样用薄层色谱、纸色谱、显色反应或沉淀反应等进行检查，判断萃取是否完全。

当被分离物质在两相溶剂中的分配系数比较接近，用分液漏斗进行多次转移操作十分不便，可改用逆流分溶仪。逆流分溶法（CCD法）是将混合物在一定的两相溶剂中，经多次移位萃取分配而分离的方法。本法与逆流连续萃取法原理相似。此法所采用的逆流分溶仪是由若干只管子组成，在两相溶剂系统中进行反复多次的振摇、静置、分离和转移等萃取步骤，使分配系数不同的成分达到分离。

CCD法是一种多次、连续的液-液萃取分离过程。如图1-9所示，在多个分液漏斗中装入密度小的固定相，然后在0号漏斗中加入密度大的流动相，振摇使充分混合，静置分层后，分出流动相移入1号漏斗，并在0号漏斗中重新补加新鲜的流动相，分别充分振摇混合。重复上述操作反复多次，混合物中各成分的分配系数不同，经多次转移后，终应在某一管中有最高浓度，故可用此法得到分离。

逆流分溶法具有很强地分离混合物各组分的能力，适用于分离性质非常近似的同系物或同分异构体以及一般方法难以分离的多肽、蛋白质等高分子化合物。同时不需要加热，对于受热易破坏的化学成分尤为适宜。但因操作较繁，消耗溶剂多，含量微小的成分易损失于大体积的溶剂中，而且反复多次地振动溶剂系统易产生乳化现象，故试样极性过大或过小，或分配系数受温度或浓度影响过大及易于乳化的溶剂系统均不宜采用此法。

液滴逆流分配法（DCCC法）又称液滴逆流色谱法，是在逆流分配基础上改进的两相溶剂萃取法，是利用混合物中多组分在两相溶液中的分配系数的差别，由流动相形成液滴，通过作为固定相的液柱而达到分离纯化的目的。由于移动相形成液滴，在细的分配萃取管中与固定相有效地接触、摩擦、不断形成新的表面，促进溶质在两相溶剂中的分配，故其分离效果往往好于逆流分配法，且不会产生乳化现象。

目前应用的装置如图1-10所示，分为三个组成部分。首先由微型泵、移动相溶剂贮存槽和试样液注入器组成输液部分；第二部分由300～500根内径约2mm、长度为20～40cm的萃取管连接而成；组成第三部分的是检出器及分步自动收集仪。操作时，先将选择好的两相溶剂中的固定相充入全部萃取管内，然后加样口注入已溶于（1∶1）两相溶剂中的待分离试样，再由微型泵注入移动相，移动相在萃取管中形成液滴，不断地与固定相有效地接触、摩擦形成新表面，促使溶质在两相溶剂中实现充分的分配，获得很高的分离效果，且不易乳化或产生泡沫，若用氮气驱动流动相，可避免被分离物质的氧化。从萃取管中流出的移动相通过检出器进行分步收集，完成液滴逆流分配的全过程。

三、沉淀法

沉淀法是在天然药物提取液中，加入某些试剂，使产生沉淀，从而获得有效成分的方法。常用方法如下所述。

酸碱沉淀法是根据酸（碱）成分与碱（酸）试剂反应成盐而溶于水，再加酸（碱）试剂反应重新生成游离酸（碱）又从溶液中析出，以达到分离目的的一种方法。

该法适用于酸性、碱性、两性化合物的分离。沉淀反应是可逆反应。

（1）碱提酸沉法　一些不溶于水的具内酯结构的化合物遇碱可开环生成羧酸盐而溶于水，再加酸酸化，内酯环重新环合后从溶液中沉淀析出，与其他成分分离；一些具有酚羟基而又难溶于水的黄酮类化合物，加碱水液可成盐溶解，经酸化后又可游离析出沉淀，借以提纯，去除杂质。

（2）酸提碱沉法　难溶于水的游离生物碱遇酸生成生物碱盐而溶于水，再加碱碱化，又能重新游离使水溶性降低而形成沉淀析出。

常用设备是多功能提取罐，适用于天然药物的常压、减压、加压水煎、温浸、渗漉、热回流，芳香油的提取及有机溶剂的回收等工艺过程操作。多功能提取罐有正锥式、斜锥式、直筒式、蘑菇式4种类型，由提取罐、消包器、冷凝管、油水分离器、过滤器构成。现代化生产线多应用提取、浓缩、加醇沉淀和分离连续进行的动态提取。

（1）水提醇沉法　在浓缩的水提取液中加入一定量的乙醇（使含醇量达50%～70%），则可沉淀除去如淀粉、树胶、黏液质、蛋白质等成分。如从栝楼中提取天花粉蛋白：取新鲜栝楼根去表皮，压汁，汁液放置过滤后离心；上清液加等量乙醇，有沉淀析出，离心除去；母液加0.5倍量乙醇，离心收集此部分沉淀，仍含有杂质；再于此母液中加1倍量的乙醇，则析出较纯的蛋白质沉淀；蛋白质用水溶解，冷冻干燥，即为天花粉蛋白质纯品。

（2）醇提水沉法　在浓缩的乙醇提取液中，加入数倍量的水稀释，即可沉淀除去树脂、叶绿素等脂溶性杂质。

（3）醇提乙醚/丙酮沉淀法　在浓缩的乙醇提取液中，加入数倍量的乙醚或丙酮，即可沉淀除去皂苷类成分，而树脂等脂溶性杂质则留在母液中。

试剂沉淀法是一种利用一些成分能与某些特定试剂产生沉淀的性质，或利用某些成分在不同溶剂中溶解度的差异，通过加入特定试剂或溶剂，使生成沉淀，与其他成分分离的方法。

（1）钙盐、钡盐、铅盐能与含有羟基及邻二酚羟基成分的酚类成分产生沉淀，如天然药物中的有机酸、氨基酸、蛋白质、黏液质、树胶、酸性树脂、酸性皂苷、鞣质、部分黄酮苷、蒽醌苷、香豆苷和某些色素等。

（2）碱性化合物如生物碱等可与有机酸盐或无机酸盐产生沉淀，常用的沉淀试剂有雷氏铵盐、苦味酸试剂等。

四、结晶与重结晶法

结晶法是分离精制固体化学成分最常用的方法之一。它是利用混合物中各种成分对某溶剂或混合溶剂中溶解度的不同而达到分离的目的。从不是结晶物质处理得到结晶状物质，叫结晶；从较不纯结晶经处理得到较纯结晶称为重结晶。天然药物化学成分在常温下多半为固体物质，大多具有结晶化的通性。一般情况下，结晶的形成标志着化合物的纯度达到了相当程度，故获得结晶并制成单体纯品是鉴定天然产物成分、研究分子结构关键的一步。

选择合适溶剂是结晶法的关键。理想的溶剂必须具备以下条件。

① 不与结晶物质发生化学反应。

② 对结晶物质的溶解度随温度不同有显著差异，热时溶解度大，冷时溶解度小；对可能存在的杂质溶解度非常大或非常小（即冷热均溶或均不溶）。

③ 溶剂有一定的挥发性，沸点适中，不宜过高或过低。

④ 所选溶剂应使被提物质容易形成晶核，这样生成的结晶才较完善，结晶产品的纯度较高，以利于固液分离。

⑤ 所选溶剂的黏度要小，能得到较好的结晶。

⑥ 尽可能安全、价廉、易得。

以下介绍选择溶剂的小量试验方法。

同一种化合物在不同的溶剂中所得结晶的形状不同，在几种溶剂同样合适时，则应根据结晶的回收率、结晶的形状、操作的难易、溶剂的毒性、易燃易爆性和价格来选择。溶剂的选择应先通过查阅文献，参考同类型化合物的一般溶解性质和结晶条件来进行。一般来说，生物碱可溶于苯、乙醚、氯仿、乙酸乙酯和丙酮；苷类溶于各种醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿；氨基酸常用甲醇或乙醇来结晶等。如果在文献中找不到合适的溶剂，可根据要结晶化合物的极性大小，利用相似相溶的原理，通过实验选择溶剂。其方法是：

取0.1g的待结晶物放入一支试管中，滴入1mL溶剂，振荡，观察产物是否溶解。若不加热就很快溶解，说明产物在此溶剂中溶解度太大，不适合作此产物的结晶溶剂；若加热沸腾还不溶解，可补加溶剂，当剂量大于4mL，产物仍不溶解时，则说明此溶剂溶解度太小。如所选的溶剂能在1～4mL、沸腾的情况下使产物全部溶解，并在冷却后能析出较多结晶，说明此溶剂适合作为此产物重结晶的溶剂。当没有一种合适的溶剂可供选择时，一般选择2种或2种以上溶剂组成的混合溶剂。

（1）溶解　将需结晶处理的固体物质或粗晶溶解于沸腾或近沸腾的适宜溶剂中。操作时可在锥形瓶中进行。若为挥发性较大或沸点较低的有机溶剂，可接上冷凝管（以防止溶剂挥发及可燃溶剂着火或有毒溶剂中毒），水浴加热至微沸，若未完全溶解，可分次逐渐自冷凝管上端加入溶剂，直至欲结晶物质刚好完全溶解，制成近饱和溶液。

（2）热滤　将溶解样品的热溶液趁热过滤，以除去不溶性杂质。注意避免在滤过过程中有结晶析出，同时熄灭附近的火源，操作应迅速。若热溶液含有色杂质，可加活性炭煮沸脱色后趁热滤过。热过滤方法有两种：常压热过滤法和减压热过滤法（抽滤）。减压热过滤装置如图1-11所示。减压装置的优点是过滤速度快；缺点是当使用沸点低的溶剂时，因减压会使热溶剂蒸发或沸腾，导致溶液浓度变大，晶体过早析出。

（3）析晶　若想获得的结晶纯度较高，宜逐渐降低温度，使结晶缓慢析出。放置过程中，先塞紧瓶塞，若久置后尚无结晶析出，可打开瓶塞，使溶剂自然挥发后析出结晶；也可用玻璃棒摩擦容器内壁或投入晶种，以诱导结晶析出。某种化合物含量高且纯度好却不易结晶时，可将其制备成易于结晶的衍生物。

（4）过滤　将结晶从母液中分出，用抽气滤过的方法使结晶与溶液分离后，滤纸上的结晶表面通常还吸附有母液，需用少量溶剂洗涤，洗涤时，抽气应暂时停止，用玻璃棒或刮刀小心拨动挑松，使晶体润湿，静置片刻后再抽气将溶剂滤去。母液适当浓缩，放置一段时间后又可析出一部分结晶。

（5）重结晶　将上述操作所得粗结晶用适当溶剂溶解，滤过，放置析晶，立即抽滤得第一批结晶，母液浓缩放置，可得第二批结晶，抽滤后再浓缩母液，经反复处理后得数批结晶，各部分结晶通过检查，相同物质可合并，最后再经多次重结晶，以获得较纯的晶体。

（6）晶体的干燥　为保证晶体的纯度，须将晶体进行干燥，把溶剂彻底除去。当溶剂沸点比较低时，在室温下使溶剂自然挥发，以达到干燥的目的；当溶剂的沸点较高时，可用红外灯烘干；如产品易吸水或吸水后易分解时，应用真空干燥装置进行干燥。

（1）一般来讲，被结晶成分的分子小易结晶；分子大、含糖多，不易结晶。溶液浓结晶快，但结晶细碎，杂质多；反之结晶慢，但晶形大、纯度高。结晶温度低、时间长，结晶好。

（2）操作过程中，若过饱和溶液放置很长时间未产生结晶，可用下列方法促进晶体析出：加晶种；用玻璃棒摩擦内壁；减少溶剂；盐析（加入无机盐氯化钠等使溶解度降低）；采用少许干冰降低结晶温度及自然挥发等。

（1）形状和色泽　结晶化合物都有一定的晶形和均匀的色泽。天然化合物多见针状结晶，其他还有粒状、片状、柱状、方形、棱柱状等。结晶的形状往往随结晶条件的不同而不同。结晶的色泽如果不均匀，并随着结晶次数的增多颜色变浅，表明结晶杂质存在，应进行重结晶操作，也可用活性炭脱色处理。

（2）熔点和熔距　一个纯化合物一般都有一定的熔点和较小的熔距。熔距指结晶开始收缩到完全熔化或分解的温度。一般来讲，单体化合物的熔距为0.5℃；植物中提取的结晶物，由于本身结构原因，熔距为1～2℃。熔距长则表示化合物不纯，但有些例外，特别是只有分解点的化合物。

五、盐析法

盐析法是在中药水提取液中加入某些无机盐至一定浓度或达到饱和状态，可使某些成分由于溶解度降低而沉淀析出，从而与水溶性成分分离。常用的无机盐有氯化钠、硫酸镁、硫酸钠、硫酸铵等。

六、透析法

透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。例如分离和纯化皂苷、蛋白质、多肽、多糖等物质时，可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。反之，也可将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制。

透析膜可在实验室自制：动物半透膜如猪、牛的膀胱膜，用水洗净，再以乙醚脱脂，即可供用。羊皮纸膜可将滤纸浸入50%的硫酸中15～60min，取出铺在板上，以水冲洗制得。其膜孔大小与硫酸浓度、浸泡时间以及用水冲洗速度有关；火棉胶膜系将火棉胶溶于乙醚及无水乙醇，涂在板上，干后放置水中即可供用，其膜孔大小与溶剂种类、溶剂挥发速度有关，溶剂中加入适量水可使膜孔增大，加入少量醋酸可使膜孔缩小；蛋白质胶（明胶）膜可用20%明胶涂于细布上，阴干后放于水中，再加甲醛使膜凝固，冲洗干净即可供用。近来有透析膜管成品出售。

七、分馏法

分馏法是利用被分离成分沸点不同而进行精制纯化的方法。一般情况下，沸点随分子量的增大和双键数目的增多而升高。该方法包含常压分馏和减压分馏两种类型。此法多用于分离天然药物中的液体混合物，如挥发油、液体生物碱等。简单分馏装置如图1-12所示。

一般情况下，如果液体混合物成分间沸点相差较大，即可通过重复多次蒸馏达到分离的目的；如果沸点相差较小，则需要采用分馏柱；沸点相差越小，需要的分馏装置就越精细。

八、升华法

利用某些具有升华性质的化合物遇热汽化上升，遇冷后又凝固的性质，从药材中提取该类成分。例如从茶叶中提取咖啡因，这是世界上最早应用升华法从天然药物中提取有效成分的实例。

升华法虽简单易行，具有特异性高、所得化学成分较纯的特点，但应用范围窄，需要化合物化学结构遇热稳定、不易被破坏，并具有升华性质。因为升华所需要的温度较高，药材容易炭化，炭化后往往产生挥发性焦油状物，黏附在升华物上，不易除去，并可使升华不完全、产率低，有时还伴随有分解现象，因此较少采用。

九、色谱法

色谱法，又称层析法，是分离和鉴定天然药物成分的有效方法之一。色谱技术的应用和发展，不断地推动天然药物各类成分的分离鉴定技术的发展。其原理就是利用混合物中的待分离物对吸附剂吸附能力不同、各组分在互不相溶的两相溶剂之间的分配系数不同以及分子的大小差异或其他亲和作用的差异，进行反复地分配或吸附，从而使混合物中的各组分达到分离。

色谱法的种类很多，根据不同的分类依据，可分为不同色谱法，见表1-2。

色谱分离过程具有以下特点：分离体系中有两相，即流动相和固定相，分离过程中流动相连续通过固定相；被分离组分与两相之间的作用力不同而分离。

常用色谱分离方法介绍如下。

柱色谱法是天然药物成分研究中常用的色谱方法之一，也称为柱层析。它是将固定相均匀地加入到一定规格的玻璃柱中，再以适当的洗脱剂洗脱，样品自上而下移动，使结构性质不同的成分达到分离。柱色谱法分离样品量大，大多数情况下为制备性分离。其按原理可分为吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱及离子交换色谱等。

（1）吸附柱色谱

① 分离原理　吸附色谱是利用吸附剂对被分离化合物分子的吸附能力的差异，而实现分离的一类色谱。用一定的溶剂系统展开时，由于溶剂与混合物中各组分争夺吸附剂活性表面，因此，发生了吸附与解吸附的过程。解吸附下来的组分与溶剂始终存在着竞争吸附作用，故随即又被吸附剂所吸附。吸附与解吸附的过程一旦开始，就必定贯穿于整个色谱过程，直至色谱结束为止。

不同的化合物由于结构上的差异，展开剂对它们的洗脱能力和在吸附剂上的吸附解吸附性能也是不同的，因而在吸附剂上移动的距离也就不会相同，使各种组分彼此程度不同地被分离。化合物极性越大，越容易被吸附，而越不容易被解吸。

吸附色谱法根据吸附剂与溶剂的存在形式不同可有固-液吸附和固-气吸附两种形式，其中最常用的固-液吸附又可分为物理吸附、化学吸附和半化学吸附。物理吸附无选择性，吸附与解吸是可逆的，速度快，实际应用最多，如采用活性炭脱色即为物理吸附；化学吸附有选择性，吸附牢固，有时甚至是不可逆的。这种方法使用的吸附剂（氧化铝）是经氢氧化铝脱水制成的，有一定碱性，不适合酸性物质的分离，应用得较少。半化学吸附是介于物理吸附与化学吸附之间的一种吸附，因此称为半化学吸附，其吸附力较弱。半化学吸附有一定应用价值。如：聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合物之间的氢键吸附属于半化学吸附。

② 吸附剂　常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭等。

硅胶是一种中等极性的酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的色谱分离。吸附作用是由于其颗粒表面有很多硅醇基，它可以和许多化合物形成氢键而具有一定的吸附作用，所以硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量有关。硅醇基还易吸附水分，吸附的水分越多，吸附其他化合物的能力越弱。但当吸水量超过12%就不能作为吸附剂使用了。当加热到100～110℃时即可除去绝大多数硅醇基吸附的水分，恢复吸附活力，这一过程称为活化。当温度上升到500℃时，硅胶表面的硅醇基则脱水缩合转变为硅氧环结构，从而丧失吸附活性。

氧化铝是一种吸附力很强的亲水性吸附剂，有酸性、碱性、中性三种规格。其吸附活性与含水量有关，随着含水量的增加，吸附能力减弱。氧化铝的吸附能力大小，可根据含水量用不同的活度级别来表示，通过活化或去活化的操作得到不同活度级别的氧化铝，一般在400℃左右加热6h，即可得Ⅰ～Ⅱ级的氧化铝。

③ 洗脱剂　洗脱剂即流动相，是由一种或几种溶剂按一定比例组成的溶剂系统，在色谱过程中主要作用是解吸作用，故流动相的选择对分离结果影响很大。一般根据被分离成分极性选择流动相。若被分离成分极性大，选择极性大的溶剂作为流动相；若被分离成分极性小，选择极性小的溶剂作为流动相。在使用极性吸附剂时，流动相的极性越大，成分的迁移速度越快，反之越慢。常用流动相极性大小顺序为：石油醚<苯<甲苯<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<水。

洗脱时，从低极性洗脱剂开始，逐步增加洗脱剂极性，使吸附在吸附剂上的组分逐个被分离出来。洗脱规律一般为：化合物的极性越强，吸附剂吸附能力越强，洗脱越慢；吸附剂含水量越大，对化合物的吸附力就越弱；洗脱剂极性越大，洗脱能力越强。

④ 溶剂、吸附剂和被分离化合物之间的关系　应用吸附色谱时，需全面考虑吸附剂、溶剂及被分离成分三者间相互联系又相互制约的关系，选择合适的条件，使达到分离的目的。如果被分离物质的极性较大，可选用活度较低的吸附剂和极性较大的移动相；如果被分离物质的极性较小，可选用活度较高的吸附剂和极性较小的移动相。

⑤ 吸附柱色谱的操作

a.色谱柱　色谱柱通常用玻璃柱。工业上大型色谱柱可以用金属制造。柱的入口端应该有进料分步器，使进入柱内的流动相分布均匀。有时也可在色谱柱顶端加一层多孔的尼龙圆片或保持一段缓冲液层。柱的底部可以用玻璃棉，也可以用砂芯玻璃板或玻璃细孔板支持固定相，最简单的也可以用铺有滤布的橡皮塞。

b.装柱　装柱分为干法装柱和湿法装柱两种。干法装柱的操作是：在柱下端加少许棉花或玻璃棉，再轻轻地撒上一层5mm厚的干净砂粒，或放置大小合适的玻璃砂芯。打开下口，然后将吸附剂经漏斗缓缓加入柱中，同时轻轻敲动色谱柱，使吸附剂松紧一致，最后，将色谱柱用最初洗脱剂小心沿壁加入，至刚好覆盖吸附剂顶端平面，关紧下口活塞。湿法装柱的操作是：先在吸附剂中加入合适量的色谱最初用洗脱剂调成稀糊状，再把放好棉花、沙子或合适大小的玻璃砂芯的色谱柱下口打开，然后徐徐将制好的糊浆灌入柱子。注意整个操作要慢，不要将气泡压入吸附剂中，而且要始终保持吸附剂上有溶剂，最后让吸附剂自然下沉。当洗脱剂刚好覆盖吸附剂平面时，关紧下口活塞。

c.上样　上样分干法上样和湿法上样两种。湿法上样的操作是：把被分离的物质溶在少量色谱最初用的洗脱剂中，小心加在吸附剂上层，注意保持吸附剂上表面仍为一水平面，打开下口，待溶液面正好与吸附剂上表面一致时，在上面撒一层细砂，关紧柱活塞。干法上样的操作是：可选用一种对其溶解度大而且沸点低的溶剂，取尽可能少的溶剂将其溶解。在溶液中加入少量吸附剂，拌匀，挥干溶剂，研磨使之成松散均匀的粉末，轻轻撒在色谱柱吸附剂上面，再撒一层细砂。

d.洗脱　在装好吸附剂的色谱柱中缓缓加入洗脱剂，进行梯度洗脱，各组分先后被洗出。若用50g吸附剂，一般每份洗脱液量为50mL。现多采用薄层色谱或纸色谱定性检查各流分中的化学成分组成。含单一色点的部分用合适的溶剂析晶；仍为混合物的部分进一步寻找分离方法再进行分离。柱色谱操作如图1-13所示。

（2）分配柱色谱　分配柱色谱是利用样品成分在固定相和流动相之间分配系数的不同而达到分离的一种色谱方法，相当于逆流连续萃取法。所不同的是把其中一种溶剂固定在某一惰性固体物质上，这种惰性固体物质只是用来固定溶剂的，本身没有吸附性，故称为“支持剂”或“载体”，而被支持剂吸附着的溶剂就叫固定相，用来冲洗柱子的溶剂则称为流动相。一般作为固定相的都是极性大的溶剂，如水、缓冲液、甲醇、甲酰胺、丙二醇、甘油等。分配柱色谱可分为正相分配色谱和反相分配色谱。装置同吸附柱色谱。将吸着固定相的支持剂装于柱中，样品溶于少量固定相加入柱上端，以移动相进行洗脱，分别收集。

① 正相分配色谱　以水或亲水性溶剂为固定相、与水不相混溶的有机溶剂为移动相的分配色谱称为正相分配色谱。即固定相极性大于流动相极性，适用于分离水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等。一般来讲化合物极性越小，越先流出柱；化合物极性越大，越后流出。

② 反相分配色谱　是用亲脂性溶剂作固定相，极性溶剂作移动相的分配色谱。即固定相极性小于流动相极性，适合于分离脂溶性化合物，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等。化合物极性越大，越先出柱；化合物极性越小，越后出柱。反相分配色谱常用支持剂为改性硅胶。

（3）聚酰胺柱色谱　聚酰胺是由许多酰胺基和非极性脂肪链聚合而成的一类链状高分子聚合物，由于其分子上存在着很多酰胺基，所以聚酰胺可与酚类的羟基、酸类的羧基、芳香硝基化合物的硝基和醌类的醌基等形成氢键吸附。主要用于酚类、醌类如黄酮类、蒽醌类及鞣质类等成分的分离。

聚酰胺对一般化合物吸附的规律是：化合物中能形成氢键的基团（酚羟基、羧基、羰基等）多，吸附强；成氢键的基团数目相同，处于对位和间位的吸附力强于邻位的；芳香环和双键多，吸附力强。

各种溶剂在聚酰胺吸附柱上的洗脱能力由小到大为：水<甲醇<丙酮<NaOH液<甲酰胺<尿素水液。

（4）大孔吸附树脂　大孔吸附树脂常应用于中药有效成分富集，具有选择性好、机械强度高、再生处理方便、吸附速度快的特点。大孔吸附树脂为白色或淡黄色球形颗粒，粒度多为20～60目。大孔吸附树脂可分为：非极性大孔树脂苯乙烯、二乙烯苯聚合物，也称芳香族吸附剂（如HPD-100、D-101等）；中等极性大孔树脂聚丙烯酸酯型聚合物，以多功能团的甲基丙烯酸酯作为交联剂，也称脂肪族吸附剂；极性大孔树脂含硫氧、酰胺基团，如丙烯酰胺；强极性大孔树脂含氮氧基团，如氧化氮类。大孔吸附树脂的结构中包含了许多微观小球组成的网状孔穴结构，其理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物选择性较好，吸附速度快，再生处理方便。

大孔吸附树脂是吸附性和分子筛性结合的分离材料，吸附性是由范德华力或氢键吸附的结果，分子筛性是由大孔吸附树脂本身的多孔性所决定的。影响大孔吸附树脂分离效果的因素有：

① 化合物分子极性大小　一般来说，大孔吸附树脂的色谱行为具有反相的性质，被分离物质的极性大先流出色谱柱。

② 分子体积大小　在一定条件下，化合物体积越大，吸附力越强。

对于非极性大孔树脂，洗脱剂极性越小，其洗脱能力越强；对中极性大孔树脂及极性较大的化合物，则极性较大的溶剂洗脱力强。一般上样后先用水（或酸、碱水）洗去杂质，然后用不同浓度的含水醇、甲醇、乙醇、丙酮等依次洗脱。如大孔树脂分离人参的操作过程为：人参提取液→通过树脂柱→水洗树脂→70%乙醇洗脱→乙醇洗脱液→回收→人参总皂苷粗品。

（5）凝胶过滤色谱　主要是分子筛作用，根据凝胶的孔径和被分离化合物的分子大小而达到分离的目的。凝胶是具有多孔隙网状结构的固体物质，当混合物溶液通过凝胶柱时，比凝胶孔隙小的分子可以自由进入凝胶内部，受到的阻力增大，流速减慢，故后被洗脱；大分子不能渗入凝胶颗粒内部，随溶剂在颗粒间移动先被洗脱。这样混合物就按分子量由大到小的顺序先后流出并得到分离。如图1-14所示。

商品凝胶的种类很多，常用的是葡聚糖凝胶、羟丙基葡聚糖凝胶等。葡聚糖凝胶（Sephadex G）是由葡聚糖（右旋糖酐）和甘油基通过醚桥相交联而成的多孔网状结构，具亲水性，只适合在水中使用。

（6）离子交换色谱　离子交换色谱法（ion exchange chromatography，IEC）是利用离子交换树脂为固定相，以适宜的溶剂作为移动相，使溶质按照它们的离子交换亲和力的不同而得到分离的方法。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配，固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。

离子交换反应的原理是树脂与被交换成分间同种电荷离子的等当量替代作用。以离子交换树脂为固定相，水或酸水、碱水为流动相，在流动相中的离子性物质与树脂进行交换而被吸附，再用适合溶剂将被交换成分从树脂上洗脱下来即可。中药中的碱性成分可用阳离子交换树脂交换、酸性成分可用阴离子交换树脂交换，然后将交换后的树脂通过调整酸碱环境使吸附物游离，选择适当溶剂将吸附物溶解出即可。由于被交换的混合物成分的酸性或碱性不同而解离度不同，与同一离子交换树脂的交换能力不同而被分离。离子交换色谱的原理可用下式表示：

阳离子交换树脂：R-H++BH+Cl- R-BH++H+Cl-

阴离子交换树脂：R-OH++RCOO-Na+R+RCOO-+Na++OH-

式中，R-H+、R+OH-分别代表阳离子和阴离子交换树脂，可交换的基团是H+和OH-。

① 离子交换树脂的分类　根据离子交换树脂中交换离子的性质不同，离子交换树脂分阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两大类。阳离子交换树脂又分为强酸性阳离子交换树脂（—SH+）和弱酸性阳离子交换树脂（—COO-H+）；阴离子交换树脂又分为强碱性阴离子交换树脂［—N+（CH3）3Cl-］和弱碱性阴离子交换树脂（—NH2、仲氨基、叔氨基等）。

② 离子交换树脂的结构和性质　离子交换树脂由两部分构成：母核和离子交换基团。母核部分是由苯乙烯通过二乙烯苯交联而成的大分子网状结构，网孔大小用交联度（即加入的交联剂的百分比）来表示。交联度越大，则网孔越小，质地越紧密，在水中不易膨胀；反之亦然。不同交联度适于分离不同大小的分子。离子交换树脂的等级如表1-3所示。常见的离子交换基团有：磺酸基（—SH+）、—N+（CH3）3Cl-、—COOH、—NH2、亚氨基等。离子交换树脂外观为球形颗粒，不溶于水，但可在水中膨胀。

薄层色谱是将固定相均匀地涂在玻璃板上，把欲分离的样品点到薄层板一边，选择适当流动相沿薄层移动进行分离。薄层色谱的操作包括：制板、点样、展开、显色及测定比移值四大步骤。薄层色谱法是一种快速、简便、灵敏的分离检识方法。

（1）薄层色谱板的制备

① 干法铺板（软板制备）　多用于氧化铝薄层板的制备。在一块儿边缘整齐的玻璃板上，铺上适量的氧化铝，取一合适物品顶住玻璃板右端。两手紧握铺板玻璃棒的边缘，按箭头方向轻轻拉过，一块儿边缘整齐、薄厚均匀的氧化铝薄层即成。

② 湿法铺板（硬板制备）　可用于硅胶、聚酰胺、氧化铝等薄层板的制备，但最常用的是硅胶硬板。为使制成的硅胶板坚硬，要加入黏合剂，用硫酸钙为黏合剂铺成的板称为硅胶G板，用羧甲基纤维素钠作黏合剂铺成的板为硅胶-CMC板。

（2）点样　用一根玻璃毛细管或点样器，吸取样品溶液，在距薄层一端约2cm的起始线上点样，每点间距约2cm，样品点直径一般小于0.5cm。注意点样量要适中，太少时，某些成分不能被检出；太多时容易产生拖尾现象，即每个斑点都拉得很长，互相重叠，不能分开。

（3）展开　展开操作需要在密闭的容器中进行。配好展开剂，将展开剂（一般为2～10mL）倒入展开缸。放置一定时间，待展开缸被展开剂饱和后，再迅速将薄层板放入，密闭，展开即开始，这样可防止边缘效应产生。另外，注意在薄层板放入展开缸时，切勿使溶剂浸没样品点。当溶剂移动到接近薄层板上端边缘时，取出薄层板，画出溶剂前沿。

薄层色谱有多种展开方式，如上行法、下行法、多次展开、双向展开等，其中以上行法最为常用。上行法是将薄层板垂直或倾斜放置，将展开溶剂加于底部，使之自下向上移运。多次展开和双向展开都可加强分离效果。

（4）显色及测定比移值　显色也称定位，即用某种方法使经色谱展开后的混合物斑点呈现颜色，以便观察其位置。迅速量出前沿至原点的总长度和原点至各个色斑的长度，依以下公式计算各色点的比移值（Rf）。

Rf=

常见的薄层色谱包括吸附薄层和分配薄层。

吸附薄层色谱是将吸附剂均匀地铺在玻璃板上，把欲分析的样品点加到薄层上，然后用合适的溶剂展开而达到分离、鉴定和定量的目的。该方法不仅对分离鉴定天然产物成分起到了独特的作用，在分析化学、药物化学、染料、农药等领域，均得到广泛的应用。

分配薄层色谱的原理和纸色谱相同。装置及操作与吸附薄层色谱相同，只是铺板用的不是吸附剂而是支持剂。需注意的是，在分配色谱中移动相应先用固定相饱和，否则在展开过程中，移动相流过支持剂就把支持剂上的固定相带走一部分或全部，最后只剩下支持剂，破坏了展开系统。

纸色谱是以滤纸作为支持剂，吸附在滤纸上的水为固定相，用一定的溶剂系统展开而使样品达到分离的一种分配色谱法。纸色谱操作简单，样品用量少，可用于天然药物有效成分的预试验，亦可用于指导分离和化合物纯度判定。基本操作同薄层色谱。

由于天然药物中各成分的类型不同，性质往往也不同，所以选择的色谱法也是不同的。总的来说，对于非极性或极性极小的成分往往考虑用氧化铝或硅胶吸附色谱；而对于极性较大的成分则采用分配色谱或弱吸附剂吸附色谱；对酸性、碱性、两性成分则多采用离子交换色谱，有时也可采用吸附色谱及分配色谱等，如表1-4所示。