第五节　聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶用于双链DNA电泳的原理和琼脂糖相似，但聚丙烯酰胺凝胶制备较复杂、困难，分离的范围较窄。聚丙烯酰胺凝胶主要优点是分辨率高，能够分辨相差1 bp的片段，可用于DNA测序和AFLP、微卫星等分子标记等检测；聚丙烯酰胺回收的DNA样品纯度高，可用于严格的实验，如引物合成和转基因动物实验时回收样品；聚丙烯酰胺的机械强度高于琼脂糖，不容易损坏。

一、聚丙烯酰胺凝胶电泳的种类

聚丙烯酰胺凝胶电泳按是否添加变性剂可以分为非变性聚丙烯酰胺凝胶（nondenaturing polyacrylamide gel）电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶（denaturing polyacrylamide gel）电泳；如果按凝胶浓度是否连续可分为连续与不连续体系两种，连续体系是指在整块凝胶的性质是相同；不连续体系也称梯度胶，整块胶的性质（如变性剂浓度）不相同或电泳过程是不相同的。常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳有以下几种：

1.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是指不添加尿素和甲酰胺等变性剂的凝胶电泳，用于双链DNA片段的分离和纯化。

2.变性聚丙烯酰胺电泳

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是指添加尿素和甲酰胺等变性剂的凝胶电泳，用于分离和纯化单链DNA片段。双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷，不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。变性聚丙烯酰胺凝胶在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上加入了变性剂（尿素和甲酰胺），从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来，常用于DNA的测序。

3.变性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳

变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）的变性梯度凝胶是在6%聚丙烯酰胺凝胶中添加线性梯度的变性剂，变性剂的浓度由上到下、从低到高成线性梯度。变性梯度凝胶电泳是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。其原理是核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称为变性，核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm主要取决于DNA分子中（G+C）%含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50～60℃，变性剂0～100%，当双链DNA片段通过温度（或变性剂浓度）呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点温度或变性剂浓度恰好使双链DNA片段的解链区域解链时，此区便开始解链，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到与其他DNA分离的效果。

Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm的升高或降低，因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。为了提高DGGE的突变检出率，可以在一侧引物的5′端加上一段30～40 bp的GC结构，这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析，这样处理可使DGGE的突变检出率提高到接近于100%。

4.温度梯度凝胶电泳系统

温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis,TGGE）采用了DGGE变性梯度凝胶电泳系统的原理，但不使用化学变性剂梯度，操作更简单、快速，便于重复。DNA上样于含尿素的聚丙烯酰胺凝胶，电泳过程中逐步、均一地升高温度，从而在电泳进行过程中产生一个线性的温度梯度，变性环境即由凝胶中均一的尿素浓度加上时间温度梯度形成。在这样的环境中，双链DNA分子之间的氢键变得热力学不稳定，带有突变的DNA片段表现出与野生型不同的解链行为，因此，通过电泳，同样长度但序列不同的DNA片段就能区分开。TGGE可以筛选出发生单个或多个碱基突变的双链DNA分子，为更加快速、准确地查找突变基因提供了一种先进技术。

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测方法

1.EB检测法

将凝胶浸于含0.5μg/mL EB的1×TBE溶液中，30～45 min后取出水洗，放紫外灯下观察电泳结果。聚丙烯酰胺凝胶对EB的荧光有淬灭现象，而且其吸附EB的能力较强，因而染色后背景较高，使得其检测灵敏度降低，只能检出含量＞10 ng的DNA条带，适合用于以DNA回收为目的的电泳。EB染色后用水漂洗一段时间再观察，或者先把样品和EB混合后再上样电泳都可以降低背景。

2.银染检测

银染时，还原剂将银离子还原，形成黄色或黑褐色的DNA条带。银染检测成本低、所用试剂安全、快速、灵敏度高，应用广泛。目前有很多文献报道不同的银染方法，各方法对同一核酸样品染色，其灵敏度和背景都会不同，所以当一种银染不够理想，可以尝试另一种银染方法，或者更换一下试剂。

聚丙烯酰胺凝胶电泳的其他检测方法见第三节。

三、聚丙烯酰胺凝胶的DNA回收

如果回收的DNA片段用于PCR扩增，可将含有DNA条带的聚丙烯酰胺凝胶切下，加适量的TE溶液，沸水上水浴5 min，冷却至室温，10000 r/min离心1 min，取适量上清液就可以作为PCR扩增的模板了。

如果电泳时上样量足够大，且要回收目的DNA片段需用于其他克隆操作，将切下的含有DNA条带的聚丙烯酰胺凝胶在保鲜膜上充分碾碎，或者在液氮下进行碾碎，然后用适量的TE溶液65℃保温30 min提取，再高速离心，取上清液用乙醇和醋酸钠沉淀即得目的DNA。由于聚丙烯酰胺凝胶不能被溶解，充分碾碎对回收率的影响至关重要，有条件的可以利用液氮使聚丙烯酰胺凝胶充分碾碎。

目前在市场上已有一些专门针对聚丙烯酰胺凝胶的回收试剂盒，其原理和琼脂糖凝胶回收试剂盒是一样，也可以直接用一些PCR产物回收试剂盒或胶回收试剂盒来对聚丙烯酰胺凝胶中DNA进行回收，其关键点还是聚丙烯酰胺凝胶的充分碾碎，碾碎后和试剂盒中的DNA结合缓冲液进行结合，然后再进行下一步的纯化。