3.6 单晶体衍射数据收集方法
3.6.1 简介
20世纪60年代中期以前，收集单晶体衍射数据的方法有劳埃法、回转法、回摆法、魏森堡法和旋进法等。这些方法均按倒易点阵和反射球的几何关系设计仪器，按照X射线能感光胶片或激发电离物质的性质，用照相或计数器等方法记录衍射强度获得衍射图。根据倒易点阵和反射球关系将衍射点指标化，用目测法或光密度扫描仪测定各衍射点的强度。从20世纪60年代中期起，不同类型的自动衍射仪相继出现，并商品化。现在最常用的是四圆衍射仪法和面探测器法，表3.4对这些方法加以比较，并在本小节介绍前面几种用感光胶片记录衍射强度的方法。
表3.4收集单晶衍射数据的各种方法的比较
劳埃(Laue)法晶体固定不动，用“白色”X射线，波长连续变化，反射球半径(1／λ)也连续改变，使一部分倒易点阵点有机会和反射球的球面相遇，满足衍射条件。如果入射X射线和晶体的某一对称轴或对称面平行，由于反射球具有圆球的对称性，由对称轴联系的各倒易点阵点必将同时落在一个球面上。由球心指向这些倒易点阵点的衍射线，将围绕入射X射线轴对称地出现，对称面的对称性也同样出现。
回转法和回摆法使用单色X射线，波长不变，反射球具有固定的半径(1/λ)。在晶体不断转动或摆动时，倒易点阵点也随着转动或摆动。当倒易点阵点扫过球面，该点满足衍射条件，产生衍射。当晶体的转轴和入射X射线垂直，垂直于转轴的倒易点阵面上的点在反射球上碰在同一水平的圆上，衍射图样出现层线形的分布。利用回摆法收集生物大分子晶体衍射数据的情况，将在6.3.2节中详细叙述。
魏森堡(Weissenberg)法先按回摆法校准晶体方向，使衍射点的层线成为直线，即所需收集的倒易点阵平面和晶体的转轴垂直。然后利用一个带有窄缝的金属圆筒形层线屏，只让某一层衍射点的射线通过窄缝，而其余各层的衍射线被挡住。收集数据时，晶体绕轴慢慢转动，层线屏外侧的圆筒形胶片同步地沿着晶体转动轴移动。晶体绕轴回摆，胶片沿轴往复移动。使回摆图中同一层线上的衍射点有规律地展开在一个平面上。衍射点不会重叠，容易进行指标化，逐点测量衍射强度。
旋进法(precession method)这方法由Buerger设计［11,12］,可收集到不变形的、放大的、低角度的倒易点阵点对应的各衍射的分布图像，它可用作正式收集强度数据前，研究蛋白质晶体的晶胞参数、对称性、空间群等晶体学数据，以及用以了解晶体的质量等情况。
旋进法原理示意于图3.17中，图中表示收集通过倒易点阵原点O的零层倒易点阵平面的衍射图。X射线入射到晶体上(晶体位置相当于O点)，衍射方向为CP方向，衍射线在P′点落在胶片上。图中r0为晶体到金属屏的垂直距离，rC为金属屏中圆形窄缝的半径，而rF为晶体到胶片中心(OF)的距离(在实际空间中可将反射球半径看作极小，晶体位置和反射球心位置看作重合在一起)。金属屏和晶体始终同步运动。
图3.17旋进照相法原理示意图（图中示出拍零层照片的情况）
为了获得不变形的倒易点阵平面衍射图，胶片要始终和该倒易点阵平面平行。当晶体和胶片不动时，在倒易点阵平面与反射球切割形成的OP圆圈上，处于反射球面的全部衍射点均满足衍射条件，金属屏上的圆圈形窄缝只让这层的衍射线通过，而其余各层的衍射线均被屏挡住。这样该零层倒易点阵平面的点阵点处在反射球面上，可在胶片上感光记录下来。为了收集该点阵平面上中心部分的全部衍射数据，必须使晶体进行旋进运动，旋进角
。这时垂直于倒易点阵平面的法线与垂直于胶片的法线围绕X射线入射方向进行旋进运动。倒易点阵面在反射球面上作圆锥角为μ的旋进运动，相当于OP为直径的圆绕O点扫过一个大圆，大圆的半径为OP，如图3.18所示。
图3.18倒易点阵平面扫过反射球面部分
在半径为OP的大圆范围内的各个倒易点阵点扫过反射球面时的衍射条件均相同，所以最后得到的衍射图保持了倒易点阵面上点阵点的分布特点，即展现了不变形的、放大的和倒易点阵点对应的衍射点的分布图像。图3.19示出α-苦瓜蛋白晶体的hk0的旋进照相图。α-苦瓜蛋白晶体的空间群为R3(No.146)，晶胞参数为：a=b=13.09nm，c=4.09nm。进行旋进照相时，μ=13°,rF=100mm。
图3.19α-苦瓜蛋白晶体的hk0旋进照相图（从图中可看出衍射点具有
的分布特点）
3.6.2 四圆衍射仪法
1.四圆衍射仪中的测角仪
收集单晶衍射数据的四圆衍射仪的核心机械部件是测角仪，它由(phi)圆、χ(chi)圆、ω(omega)圆和2θ(2 theta)圆组成。图3.20示出四圆衍射仪中的测角仪部分示意图。圆是指围绕安置晶体的轴旋转的圆，即测角头绕转轴自转的圆，旋转角称角；χ圆指安装测角头的垂直圆，测角头可在此圆上运动；ω圆是通过衍射仪中心的垂直轴使χ圆绕垂直轴旋转的圆，亦即晶体绕垂直轴转动的圆；2θ圆和ω圆共轴，载着探测器转动的圆。圆、χ圆和ω圆的作用是共同调节晶体的取向，将需要测定的衍射hkl的Hhkl矢量调到水平位置，并使晶体旋转到让Hhkl矢量端点和反射球面相碰，产生衍射;2θ圆的作用是让衍射线进入探测器。4个圆共计有3个轴，这3个轴和入射X射线在空间上相交于一个点，该点即晶体所处的机械中心位置。在收集衍射数据的运转过程中，晶体始终处于该中心位置。每个圆都是由独立的马达带动，通过计算机控制，让晶体的各个衍射hkl在特定的取向条件下满足衍射条件，记录衍射强度。
图3.20四圆衍射仪中测角仪的结构示意图
不同型号的四圆衍射仪中的测角仪都是根据图3.20所示的基本要求和原理进行设计制造。图3.21示出现在常用的两种衍射仪商品中测角仪的结构，(a)是Nonius公司生产的测角仪，(b)是Nicolet和理学（Rigaku）公司生产的测角仪。
图3.21四圆衍射仪中常见的测角仪的结构（a） Nonius公司生产；（b） Nicolet和理学（Rigaku）公司生产
2. 反射球和测角仪4个圆的几何关系
四圆衍射仪收集衍射数据的方法是用计算机程序进行控制，对一个一个衍射hkl逐点地收集。即将每个矢量Hhkl调节到反射球的赤道平面，使Hhkl端点和反射球面相切，产生衍射，同时调节探测器的2θ圆，使计数器准确地对着衍射线，记录衍射强度。图3.22示出反射球和晶体衍射hkl的矢量Hhkl的关系，以及通过计算机逐点地将Hhkl用圆、χ圆和ω圆调节的情况，即：
图3.22反射球和测角仪中4个圆的关系
圆: 将Hhkl矢量由OP0调节到OP1
χ圆: 将Hhkl矢量由OP1调节到OP2
ω圆: 将Hhkl矢量由OP2调节到OP3
这时P3点处在反射球赤道平面的球面上。从反射球球心到P3的连线即衍射矢量S的方向，衍射角为2θ。
3. 四圆衍射仪收集衍射数据的步骤
利用四圆衍射仪收集衍射数据大体上按下述步骤进行：
(1) 安放晶体：用光学显微镜挑选外形规整、晶棱晶面清晰、大小合适的单晶体（线度为0.3mm，无机晶体样品尺寸还可小些）。根据晶体样品的性质，如对湿度敏感，可密封；晶体样品对室温环境稳定，可用玻璃毛，黏胶粘好所选的晶体；若晶体样品对温度敏感，可用凡士林，低温胶快速粘上，待胶干后安置于测角头。进行光学（机械）调心。
(2) 寻峰和指标化：开机，X射线光源调成所需的功率（管压和管流）打开快门，用仪器系统控制软件，自动寻找25个衍射峰以确定晶体的晶胞参数和取向矩阵并精修。
有了方位矩阵，就可测试一些衍射斑点的峰形，以此判定和控制晶体衍射质量。若有必要，在这里找适当数目的Friedel对，进行最小二乘修正，利于得到更精确的方位矩阵和晶胞参数。用精确的晶胞来进行晶胞变换为还原晶胞（对称性更高，或体积更小），核实系统消光。若衍射数据不好，宜立即更换晶体样品。
(3) 编制收集衍射数据指令文件：按晶体所属晶系和Laue点群，设定收集衍射数据条件，编制一个指令文件控制收集衍射数据过程，包括收集数据的范围、收集次序、扫描方式、扫描宽度、扫描时间等，还要选3～4个监测点，在数据收集自始至终按一定周期重复测量其强度，了解晶体在收集强度过程中晶体位置有无变动、晶体有无衰变和光源强度的稳定性，以便及时加以处理。
(4) 收集衍射数据：检查收集数据控制文件的各项指令。一切无误，即可启动。按指定次序逐一扫描每个衍射点的积分强度。在收集数据过程中要经常检查其运行情况。数据收集完成后，不忙取下晶体样品。
(5) 进行吸收校正和数据处理：根据晶体的晶面和外形尺寸，进行吸收校正。然后对衍射数据进行处理，即将数据通过统一、还原（参看4.6节），形成衍射数据的初始文件，供测定结构的后续工作使用。
3.6.3面探测器法
四圆衍射仪法收集的衍射数据精确度高，是收集无机物和有机物小分子单晶衍射数据的理想仪器。但它是逐点收集，同一时间只收集一个衍射点，当遇到晶胞很大的蛋白质晶体或其他晶体时，耗时过多。特别是用高强度同步辐射作X射线源，不能用四圆衍射仪来收集衍射数据。
回摆法结合成像板（imaging plate,IP）或电荷耦合器件（charged couple device,CCD）等类型的面探测器，可在短时间内同时记录大量的衍射数据，已成为收集衍射强度的重要方法。图3.23示出平面探测器的安排。
图3.23平面探测器IP和CCD的安排
成像板是一种磷光物质储存感光信息的平板器件。当晶体衍射线入射到板上时，将板中磷光物质感光而形成潜像。用激光照射到潜像板上，储存信息的磷光物质会发射不同波长的光，通过光电倍增器将这种光转换成放大的电信号。成像板可将衍射信息储存一定时间，用过以后又可用激光擦除原有信号，反复多次使用。详细情况请参看6.3.1节。
在回摆法中，晶体绕轴在一定角度内摆动，许多倒易点阵点和反射球相切，产生衍射。衍射数据信息（即衍射点的位置和强度）被记录在面探测器上。摆动角度的大小可根据晶胞大小进行选择。为了避免衍射点的信息相互重叠，晶胞大者，摆动角度可以小一些，例如摆动角度为2°,即每隔2°收集的衍射信息记录在一张成像板或CCD器件上。晶体的取向，即摆动轴不要求按照相法那样绕一个晶轴摆动。但需要在正式收集数据前，通过少量的衍射数据了解晶胞大小和取向，以及晶体所属的晶系和Laue点群。
面探测器衍射仪收集衍射数据过程可按下述步骤进行：
(1) 用光学显微镜选好晶体样品（注意外形和尺寸），将晶体安放于测角头上，光学调心，调晶体-探测器距离（根据衍射点强度和密集度，以及所要求的分辨率）。开机，选定X射线强度（管压，管流），收集十余张衍射图（IP系统只需2～3张）。指标化衍射点，确定晶体的质量、晶胞参数和取向、晶体所属晶系和Laue群。
（用面探测器法，从原理上来说，可以不知道晶体的晶胞参数和取向进行数据收集，但无法确定最佳数据收集条件，也极可能造成后续的数据处理的困难。）
(2) 根据晶体的晶胞参数和取向，晶体所属晶系、Laue点群，以及衍射斑点质量，制定数据收集方案，包括：
① 选择面探测器到晶体的距离，以及每张回摆图的晶体回摆角度的大小，以减少或避免衍射点在回摆图上的重叠。
② 选择面探测器的2θ角度，在满足分辨率要求的前提下充分利用面探测器的有效面积。
③ 选择晶体回摆角度、回摆范围和方式（扫描和ω扫描），按数据完全度的要求和仪器几何的设置消除盲区。
④ 按所用衍射仪的性能选择每张回摆图的曝光时间、分辨率的要求。
(3) 按预先制定的数据收集方案收集数据。
(4) 收集完数据，不忙取下晶体，接着进行测量晶体的晶面和外形尺寸的吸收校正。浏览和检查整套数据，根据情况，（最好是）再收集一套数据，进行平均、归并，利于提高数据完整性和质量。
由上面讨论可见，四圆衍射仪法和面探测器法收集晶体的衍射数据各有其特性和优点，如表3.5所列。随着科学技术的发展，平面探测器法由于效率高、操作方便，已日益显示出它的优势。
表3.5四圆衍射仪与面探测器衍射仪的比较
