第7章　直接抗人球蛋白试验阳性的诊断思路

直接抗人球蛋白试验(direct antiglobulin test,DAT)是通过抗原抗体反应测定结合在红细胞膜上的不完全抗体或补体的方法,DAT由Coombs于1945发明,因此也被称为Coombs试验。针对红细胞抗原的不完全抗体(绝大部分为IgG,极少数为IgA或IgM)或补体(C3)吸附在红细胞膜上,使红细胞致敏,不完全抗体或补体的Fc段与抗人球蛋白发生特异性的抗原抗体结合反应,使致敏的红细胞发生凝集。

抗人球蛋白试验有直接法和间接法两种,分别检测红细胞膜表面和血清中的不完全抗体,其中直接法最为常用,抗人球蛋白早期通常是人血清免疫家兔的多价抗血清,目前用提纯IgG或补体C3等免疫家兔的单价抗血清进行试验可提高阳性率,并可确定抗体类型。

抗人球蛋白试验阳性是诊断免疫性溶血性贫血的重要证据,DAT阳性可见于自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia,AIHA)、同种异体抗体诱发的免疫性溶血以及药物诱发的免疫性溶血性贫血(表7-1),其中以AIHA最为常见。

DAT可出现假阳性,如某些药物(如头孢菌素)改变红细胞膜的性状,或高免疫球蛋白血症均可导致体内免疫球蛋白非特异性地吸附在红细胞膜上而出现DAT假阳性。DAT出现假阴性可见于以下情况:①红细胞表面吸附少于500个IgG分子;②检验过程操作不当或特异性抗体与红细胞结合较疏松,抗体从红细胞表面脱落;③检验过程未将血浆中的人免疫球蛋白彻底去除,中和了试剂;④引起免疫性溶血的抗体为IgA或IgM型。因此,DAT阴性结果不能完全排除免疫性溶血性贫血。

DAT阳性常见于以下疾病。

AIHA由于人体免疫识别功能紊乱产生自身抗体和(或)补体,结合于红细胞表面而引起的一种溶血性贫血,DAT试验大多阳性。依据自身抗体作用于红细胞的最佳温度,AIHA通常分为温抗体(一般在37℃)和冷抗体(<37℃)两大类,兼有温、冷双抗体罕见;按病因又可分为原发性(原因不明性)及继发性两大类,不同类型抗体AIHA继发病因不同,明确继发因素后,以治疗原发病为主。

在AIHA占绝大多数,其中以女性多见,尤其是在原发性AIHA中。如果同时出现免疫性血小板减少,则称为Evans综合征。超过半数以上温抗体型AIHA为继发性,可继发于淋巴细胞增殖性疾病如淋巴瘤、风湿结缔组织病如SLE、其他恶性肿瘤如卵巢癌、慢性非特异性炎症如溃疡性结肠炎等,以风湿病最为多见。因此确定温抗体型AIHA后,应进一步寻找风湿病、淋巴瘤等相关临床症状、体征及实验室依据,确定有无继发基础疾病,尤其是对糖皮质激素治疗无效、依赖或反复复发患者。

冷凝集素综合征(cold agglutinin syndrome,CAS)少见,多发生中、老年人,自身抗体几乎均为凝集素IgM抗体,为完全抗体,在<37℃环境中可直接在血液循环中吸附在红细胞上引起红细胞聚集并与补体结合,使补体固定在红细胞膜上;当血液流向身体深部,温度升高,IgM抗体与红细胞分离,但吸附在红细胞膜上的补体直接活化或在肝脾巨噬细胞调理作用下导致红细胞被破坏。凝集素IgM抗体在外周引起红细胞聚集可出现手足、耳廓等处皮肤发绀,静脉抽血可发现有红细胞自凝现象,血常规可出现假性MCV增大;冷凝集素试验阳性,效价可高达1∶100以上。CAS分为原发性与继发性两大类,继发性CAS见于支原体感染、传染性单核细胞增多症等感染后以及恶性B淋巴细胞增殖性疾病,继发性CAS预后与原发病相关,因此CAS诊断后宜进一步寻找继发因素。

阵发性冷性血红蛋白尿(paroxysmal cold hemoglobinuria,PCH)由冷溶血素引起,为一种特殊的冷抗体(7SIgG),又称为冷热抗体(donath-landsteiner antibody,D-L抗体)。环境温度低于20℃,外周血液循环D-L抗体结合于红细胞上并激活补体,当血液流向身体深部,温度升高,抗体与红细胞分离,吸附在红细胞膜上的活化补体导致红细胞被破坏,故出现特征性的受寒后突发血红蛋白尿症状,抗人球蛋白试验C3阳性、D-L试验阳性可确诊。PCH可继发于儿童急性病毒感染,罕见于成人梅毒。

新生儿同种免疫性溶血病指由于母亲与胎儿血型不合,母亲体内产生与胎儿血型抗原相对应的抗体,抗体通过胎盘进入到胎儿体内引起的一种免疫性溶血,主要包括Rh血型不合和ABO血型不合。母子Rh血型不合,D抗原免疫源性强,刺激Rh阴性母体产生Rh抗体,经胎盘与胎儿红细胞表面D抗原结合即可引起红细胞破坏,胎儿血DAT呈强阳性;母子ABO血型不合常见,母体内有血型A或B的天然抗体,抗原性弱,故胎儿血DAT可为弱阳性或阴性。患儿有溶血性贫血,检查患儿及其父母的Rh和ABO血型确立存在母子血型不合,结合胎儿血DAT阳性,即可明确诊断。

可引起DAT阳性的常见药物包括头孢类和青霉素类抗生素、非甾体类抗炎药物以及奎宁。如患者发病前有使用可疑药物史,需考虑药物诱发AIHA的可能。药物诱发的AIHA大多数也是温抗体型,与其他原因引起的温抗体型AIHA在临床表现上并无差异,因此临床上非常难以鉴别,停用可疑药物后溶血发作停止则可明确为药物诱发的AIHA。

风湿性疾病由于免疫功能紊乱如SLE患者可产生多种自身抗体,可出现DAT阳性,患者可无溶血发作。结合患者相关症状体征和实验室检查一般可明确诊断。

淋巴细胞增殖性疾病如霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤等由于免疫功能异常,异常B淋巴细胞可产生自身抗体,DAT可呈阳性,患者可无溶血发作。

免疫缺陷性疾病分为先天性(如先天性低丙种球蛋白血症)和后天获得性(AIDS),患者常同时伴有自身免疫性疾病,DAT可呈阳性。其中AIDS患者合并溶血性贫血时,输注红细胞可发生致命的严重输血反应,因此应常规筛查DAT。

苏某,女,26岁,因“咳嗽3个月余,发热、头晕伴解咖啡色尿2个月余”于2011年12月28日入院。患者3个月前分娩后无明显诱因出现咳嗽,伴咳黄色痰,2个月前出现发热,体温最高达41℃,伴畏寒、寒战,同时出现头晕、胸闷,活动后加重,休息后好转,伴咖啡色尿,晨起明显,后尿液逐渐变浅,遂就诊于当地医院,予青霉素、美洛西林抗感染治疗后症状无好转。为进一步诊治就诊于当地市人民医院,查血常规示WBC 5.46×10 ⁹/L,Hb 55g/L,PLT 171×10 ⁹/L,MCV 92.1fl,MCHC 28.9pg,MCHC 314g/L;外周血涂片示小部分粒细胞胞质出现颗粒增粗现象,红细胞部分大小不等,中心淡染区扩大;骨穿示骨髓增生活跃,粒系出现中毒性颗粒,核质肿胀,有核红类巨幼变。Coombs试验阳性,血沉96.2mm/h;贫血组合Ⅲ示铁蛋白>1650ng/ml,叶酸6.35ng/ml,维生素B ₁₂ 812pg/ml;风湿免疫相关无明显异常。胸部CT示双肺渗出性病变,考虑双肺炎症;腹部B超示胆囊多发息肉,脾稍大,脾厚46mm,肝、胆管及胰腺未见异常。拟诊为“自身免疫性溶血、肺部感染”,予人免疫球蛋白(25g qd×2天)及甲强龙(80mg iv.dri qd)抑制溶血治疗,同时先后予头孢哌酮-他唑巴坦、左氧氟沙星、亚胺培南-西司他丁、头孢曲松、阿奇霉素抗感染治疗后,复查胸部CT示双肺渗出性病变较前有所吸收,左侧胸腔积液较前减少,右侧胸腔积液较前稍增多,肝脏饱满,脾大,体温降至正常,间断有低热。患者咳嗽较剧烈,偶伴咳血丝痰,予氨溴索治疗后咳嗽、咳痰症状好转,血红蛋白呈进行性下降,予以输注洗涤红细胞、补液、口服叶酸、维生素B ₁₂治疗后症状无好转。为进一步诊治转入省人民医院,查血常规示Hb 52g/L,予血浆置换、甲强龙治疗(12月12日予甲强龙120mg qd症状好转,12月15日减量至100mg,患者再次出现尿液颜色加深,于12月19日加量至160mg qd),同时先后予亚胺培南-西司他丁、替考拉宁、阿奇霉素、帕尼培南抗感染治疗,患者体温无下降,仍有反复发热,血红蛋白仍继续下降,最低至32g/L。为进一步诊治就诊于我院急诊,查血常规示Hb 29g/L;贫血组合Ⅲ示铁蛋白6015.64μg/ml,叶酸16.7μg/ml,维生素B ₁₂ 3608ng/ml;Coombs试验弱阳性;体液免疫7项:IgA、IgG、IgM全部下降;SLE 5项、PNH组合、HIV抗体、梅毒组合无明显异常。现为进一步诊治由急诊转入我科。患者起病以来,有发热、盗汗,无关节痛、口腔溃疡、脱发,无腹痛、腹泻、恶心、呕吐,无在寒冷环境中肢端发绀,精神、睡眠一般,胃纳可,大便正常,小便咖啡色,体重近期下降约14kg。

既往体健,2011年9月18日分娩后至今月经未来潮。否认抗结核、抗疟疾药物服用史。否认起病前输血史。否认其他遗传病、传染病、精神病及类似疾病史。

体格检查:T 37.3℃,P 110 次/分,R 20次/分,BP 120/80mmHg。发育正常,营养中等,重度贫血貌,全身皮肤及黏膜苍白,无发绀、黄染、全身浅表淋巴结未触及肿大。巩膜无黄染,胸骨中下段无压痛,双肺呼吸音清,未闻及干湿性啰音。心界不大,心率110次/分,各瓣膜听诊区未闻及病理性杂音,无心包摩擦音。腹部平坦,未触及腹部肿块。肝脾肋下未触及。肛门及外生殖器未查。脊柱生理弯曲存在,四肢无畸形,无反甲。四肢活动自如,无杵状指(趾),双下肢无水肿。生理反射正常,病理反射未引出。

血常规和尿潜血结果见表7-2。

大便常规检查未见异常,隐血试验阴性。

尿常规:尿液呈红色,尿蛋白阳性(++),尿酮体弱阳性(±),尿胆原阳性(+),尿隐血阳性(+++),尿红细胞(镜检)阴性。

肝肾功能:LDH 456U/L,其余未见异常。

贫血组合Ⅲ:维生素B ₁₂ 1475.00ng/L,铁蛋白24783.44μg/L,叶酸5.35μg/m l,促红细胞生成素>200IU/L。

直接Coombs试验阳性,G-6-PD活性正常(3233U/L)。

感染相关检查:巨细胞病毒抗体CMV-IgG>250.0IU/ml,CMV-IgM阴性;EB病毒抗体IgM及IgA均阴性;肝炎系列阴性,乙肝表面抗体HBsAb(+);HIV抗体和梅毒组合均阴性;冷凝集试验阴性;PPD皮试阴性。

风湿免疫相关检查:CRP 69.40mg/L↑,SAA 142.00mg/L↑;IgA 1.42g/L↓,IgM 0.55g/L↓,IgG 9.49g/L↓,补体C4<0.0635g/L↓,κ链6.94g/L↓,λ链2.95g/L↓。

消化系统肿瘤组合Ⅰ、妇科肿瘤组合、肺肿瘤组合均未见异常。

心电图检查:窦性心动过速。

全身PET-CT检查(图7-1):①肝脾轻度大,代谢弥漫性轻度活跃,肝SUVmax 2.7,脾SUVmax 2.3;②骨盆骨及四肢长骨近段骨髓代谢活跃,SUVmax约2.6;③双侧胸腔少量积液,双肺散在多发小斑片影,代谢未见增高,考虑炎症,建议治疗后复查;④心腔密度减低,符合贫血改变。

左髂前上棘骨髓涂片:骨髓增生明显活跃,粒红比为0.85∶1;粒系35%,比例减低,形态大致正常;红系41%,比例增高,可见核间桥、花瓣核、核出芽等现象;见15%分类不明细胞,其胞体中等大小,以圆形、类圆形为主,胞质量少或中等,蓝色,无颗粒,偶见空泡变性,胞核类圆,染色质细致疏松,见核仁1～3个(图7-2);全片见巨核细胞110个,原始巨核细胞2%,幼稚巨核细胞6%,颗粒巨核细胞74%,产板巨核细胞2%,裸核巨核细胞16%,血小板小簇分布。外周血涂片:白细胞数在正常范围,分类以中性分叶核粒细胞为主,见核左移及颗粒增粗现象;成熟红细胞形态大致正常;血小板小簇分布。

骨髓流式细胞学检测:P5为异常细胞,抗原表达为HLA-DR 97.7%,CD79a 85.5%,CD20 94.4%,CD22 94.9%,CD19 93.3%,FMC7 36.6%,CD5 42.5%,CD23 0.8%,CD13 22.0%,CD56 82.6%,CD24 96.6%,CD38 97.8%,sκ98.3%,sλ0.7%(图7-3)。

Evans综合征:①继发于B细胞淋巴瘤?②继发于结缔组织病?

该患者为年轻女性,分娩后发病,病程3个月;反复发作难以控制的Coombs阳性的血管内溶血,对糖皮质激素、大剂量丙种球蛋白冲击以及血浆置换术无效;反复发热,伴有咳嗽、咳血丝痰肺部感染症状,应用多种广谱强效抗生素包括碳青酶烯类、头孢哌酮-他唑巴坦、左氧氟沙星、替考拉宁、阿奇霉素抗感染治疗后发热控制不佳;伴有盗汗、体重下降、发热等消耗症状。浅表淋巴结未触及肿大,影像学检查提示肝脾轻度大,代谢增高;骨髓穿刺见分类不明细胞占15%,流式检查提示该群细胞为克隆性异常B细胞。

患者的诊断和鉴别诊断可以从发热查因、骨髓见分类不明细胞、LDH升高、巨核细胞成熟障碍、直接抗人球蛋白阳性等多个切入点进行分析,具体参见本书相关章节。本病例从直接抗人球蛋白阳性为切入点进行讨论。

患者有血红蛋白极重度减低、血红蛋白尿、LDH升高、骨髓红系代偿增生等溶血性贫血的表现,结合DAT阳性,分析存在自身免疫性溶血性贫血,同时有血小板减少、骨髓巨核细胞增多伴成熟障碍,故诊断为Evans综合征。患者起病前无特殊用药史,因此可排除药物诱发因素。该患者无在寒冷环境中肢端发绀的表现,因此可确诊为温抗体型AIHA。温抗体型AIHA按病因学分类可分为原发性和继发性,继发性AIHA病因包括B细胞淋巴瘤、结缔组织病、感染等。详细分析如下:

B细胞淋巴瘤是引起AIHA常见继发病因。其中以慢性淋巴细胞白血病最为多见。该患者支持B细胞淋巴瘤的依据:①反复发热,广谱抗生素治疗效果不佳;②伴有盗汗、体重下降超过体重10%;③PET-CT提示肝脾、骨髓代谢增高;④骨髓穿刺见分类不明细胞占15%,流式检查提示该群细胞为克隆性异常B细胞。因此,高度怀疑该患者为B细胞淋巴瘤。患者外周浅表及深部淋巴结均无肿大,脾无明显增大,无法进行相关的活检病理检查。PET-CT及骨髓涂片均提示骨髓受累,骨髓活检病理将有助于明确诊断。

患者为年轻女性,分娩后即发病,为风湿免疫性疾病高发人群;风湿性疾病如SLE可见以严重的AIHA为首发症状。但患者无典型面部皮疹、光过敏、脱发、口腔溃疡、关节炎、肾损害等风湿病表现,风湿免疫检查未见ANA、抗dsDNA等异常。暂不支持风湿性疾病的诊断。

支原体感染、EB病毒引起的传染性单核细胞增多症均可诱发AIHA。该患者最初起病症状为咳嗽、咳痰,多次CT检查均提示双肺多发渗出性病变,需考虑支原体肺炎感染诱发的AIHA。但该患者冷凝集试验阴性,使用针对支原体的阿奇霉素、左氧氟沙星无效。患者无EB病毒感染引起的扁桃体肿大、白膜、全身淋巴结肿大,EB抗体阴性,外周血未见异形淋巴细胞,不考虑EB病毒引起的AIHA。患者无肝炎病史,肝炎系列检查阴性,可排除肝炎病毒诱发的AIHA。上述各种感染均不能解释骨髓中出现克隆性异常B淋巴细胞;而且患者AIHA病史持续约3个月,超过一般病毒感染的病程。因此基本可排除由感染引起的AIHA。

非淋巴类肿瘤如髓系白血病、实体肿瘤偶可诱发AIHA。该患者有呼吸道症状,但影像学检查提示双肺渗出病变而并非为结节样或团块样病变,也未表现为肺泡癌的弥漫性间质病变,CEA等肿瘤标志物无升高,呼吸道症状经过抗感染治疗后好转,复查双肺渗出性改变较前吸收。上述特点均不支持肺恶性肿瘤。患者也无消化道、妇科等部位肿瘤的相关症状、体征及肿瘤标志物升高,可排除由实体肿瘤引起的AIHA。患者骨髓涂片也可排除急性髓细胞白血病。

2012年1月7日骨髓活检病理(图7-4):镜下见骨髓增生明显活跃,骨髓腔内可见弥漫分布的淋巴细胞,细胞体积中等至大,核大,核仁明显,核分裂象多见。免疫组化:淋巴细胞CD79a(+),L26(+),CD10部分细胞(+),Bcl-2部分细胞(+),Ki-67约70%,CD3、UCHL、TdT、CD99、MPO、CD34、CD117、CD23、CD61、CD5、Bcl-6、Cyclin D1均(-)。病变符合B细胞性淋巴瘤,弥漫大B细胞性淋巴瘤可能性大。

Evans综合征:继发于弥漫大B细胞淋巴瘤(ⅣB期)

于2011年12月31日起予R-CHOP方案化疗,化疗过程中患者的尿色逐渐转清,红细胞开始输注有效,化疗结束后血红蛋白稳步上升。2012年1月22日复查血常规示血红蛋白上升至110g/L,Coombs试验阴性。遂于1月23日、2月14、3月7日始予R-CHOP方案[利妥昔单抗注射液(美罗华)700mg qd d ₀,CTX 1.3g qd d ₁,VCR 2mg qd d ₁,DXM 10mg qd d _1～5]化疗3次。复查骨髓活检未见淋巴瘤细胞浸润,复查PET-CT提示CR。后再予R-CHOP方案化疗4个疗程,化疗过程顺利,患者未再发作溶血性贫血。现定期门诊随访中。

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