第一章　液相色谱技术及应用

第一节　概述

一、液相色谱发展简史

从20世纪初色谱法发明以来，经历了整整一个世纪的发展，到今天液相色谱法已经成为最重要的分离分析方法，广泛地应用于许多领域，如石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、食品、环境保护乃至空间探索等。

在所有色谱技术中，液相色谱法（liquid chromatography，LC）是最早发明的。1906年俄国植物学家茨维特（Tswett）将吸附原理应用于植物色素的分离实验，用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。由于这一实验将混合的植物色素分离为不同的色带，因此茨维特将这种方法命名为色谱法（chromatography），这个词是由希腊语中“色”的写法chroma和“书写”（graphein）这两个词根组成的，派生词有chromatograph（色谱仪）、chromatogram（色谱图）、chromatographer（色谱工作者）等。这个单词最终被英语等拼音语言接受，成为色谱法的名称。汉语中的色谱是对这个单词的意译。

1931年德国柏林威廉皇帝研究所的库恩将茨维特的方法应用于叶红素和叶黄素的研究，其研究成果获得了科学界的广泛承认，色谱法正式进入学术界。之后，在有色物质的分离中，以氧化铝为固定相的吸附色谱法受到众多研究者的青睐。

1938年马丁和辛格将水吸附在固相的硅胶上，以氯仿冲洗，成功地分离了氨基酸，成为分配色谱应用的第一个成果。在获得成功之后，马丁和辛格的方法被广泛应用于各种有机物的分离。1943年马丁和辛格又发明了在蒸汽饱和环境下进行的纸色谱法。

1952年马丁和詹姆斯提出用气体作为流动相进行色谱分离的设想，他们用硅藻土吸附的硅酮油作为固定相，用氮气作为流动相分离了若干种小分子量挥发性有机酸，完成了最早的气相色谱实验。气相色谱法在这一时期发展迅速，不同特性的检测器不断涌现，同时，在色谱学理论中有着重要地位的塔板理论、范德姆特（Van Deemter）方程和保留时间、保留指数、峰宽等概念也逐渐成形。尽管这一时期，液相色谱发展仍十分缓慢，但气相色谱的检测器技术和色谱理论的发展为后期液相色谱的发展奠定了基础。

自1906年茨维特分离植物色素至1960年代末的液相色谱技术又称为经典液相色谱技术，这一时期的液相色谱通常用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，此方法由于使用的填充粒大于100μm，提高柱效面临着困境，所以色谱分离效果差、时间长。

1969年，科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了液相色谱的新时代。之后，小粒径全多孔球形硅胶和稳定性键合固定相的出现，大大提高了色谱柱的塔板数，同时借助往复式双柱塞恒流泵以高压驱动流动相克服小粒径填料引起的高阻力，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成，由于这种液相色谱技术具有高压、高速、高分离度的特征，因此被称作高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）。

1971年，科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。现代意义的HPLC发展也自此进入高速推进的快车道。作为一种有效的分离检测手段，HPLC在化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、检验检疫和法检等领域都展现出独特的优势。此外，HPLC也直接推动了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。

1973年，第一届国际液相色谱会议在瑞士的因特拉肯举行，这是一次HPLC研究者的盛会，HPLC的研究及展示在会议中获得了大量学者的关注，其中几乎50%以上的论文将讨论的重点集中在色谱柱的问题上，其余论文则关注了HPLC的检测器和实际应用。

到20世纪80年代中期，计算机模拟预测高效分离结果与实际实验相结合，使计算机逐渐承担了色谱分析结果的繁重数学计算工作。期间，科达（Ko dak）实验室中已经能够利用对聚合度为反相键合色谱柱分离900多种多聚取代磺酸芳香高级性化合物；雷格里尔、哈恩和汉卡克以及他们的同事建立了对映体（手性异构体）和大生物分子如蛋白质的HPLC方法；超临界流体色谱法（SFC）、毛细管电泳（LZE）、制备色谱法（PC）等也逐渐开始应用。

近年来，HPLC的色谱柱改进和完善进程更是迅速，亚2μm粒径、各种修饰已成为当前应用的热点；超高压输送泵的出现则不仅缩短了分离时间，而且将高效液相色谱的有效塔板数提高了数百倍，使分离效率飞速提高。

经过30多年的发展，现代高效液相色谱技术得到了不断的完善和改进，在输液泵、检测器、色谱柱及数据控制和处理系统等方面采用了许多专利技术，使泵的稳定性和重复性、检测器的灵敏度和检出能力、色谱柱的分离效能和应用范围及数据处理软件的智能化得到了很大的提高。现在，HPLC几乎能够分析所有的有机、高分子及生物试样，在目前已知的有机化合物中，若事先不进行化学改性，只有20%的化合物用气相色谱可以得到较好的分离，而80%的有机化合物则需HPLC分析。在短短的30多年里，HPLC从初步成形发展成为成熟而广泛应用的分析方法。目前，HPLC在化学、生物医药、食品等领域的分离和分析中已是不可或缺的重要技术。