第四节　酶化学修饰的应用

20世纪50年代末期，化学修饰酶的目的主要是用来研究酶的结构与功能的关系，是当时生物化学领域的研究热点。它在理论上为酶的结构与功能关系的研究提供实验依据。如酶的活性中心的存在就是可以通过酶的化学修饰来证实的。为了考察酶分子中氨基酸残基的各种不同状态和确定哪些残基处于活性部位并为酶分子的特定功能所必需，研制出许多小分子化学修饰剂，进行了多种类型的化学修饰。自70年代末以来，用天然或合成的水溶性大分子修饰酶的报道越来越多。这些报道中的酶化学修饰的目的在于人为地改变天然酶的某些性质，创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性，扩大酶的应用范围。酶经过修饰后，会产生各种各样的变化，概括起来有：①提高生物活性（包括某些在修饰后对效应物的反应性能改变）；②增强在不良环境中的稳定性；③针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫原性；④产生新的催化能力（图3-12）。

一、化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用

化学修饰在研究酶的结构与功能方面应用的比较多，研究的也比较细，特别是可逆的化学修饰在酶结构与功能的研究中能提供大量信息。

1.研究酶空间结构

酶分子中氨基酸侧链的反应性与它周围的微环境密切相关，用具有荧光性质的修饰剂修饰后，通过荧光光谱的研究，可以了解溶液状态下的酶分子构象；研究酶分子的解离-缔合现象。通过荧光偏振技术还可以测酶分子的旋转弛豫时间，由此推算出酶分子大小、形态及构象变化。用化学修饰法确定某种氨基酸残基在酶分子中所存在的状态是一常用的方法。通常情况下酶分子表面基团能与修饰剂反应，而不能与修饰剂反应的基团一般是埋藏在分子内或形成次级键。

通过双功能试剂交联修饰可以测定酶分子中特定基团之间的距离。在酶的晶体结构分析中，有时需要用化学修饰方法制备含重原子的酶分子衍生物，这将有利于晶体结构分析。

2.确定氨基酸残基的功能

化学修饰与底物保护相结合，可用于研究底物对修饰速度和修饰程度的影响。如果修饰反应的可逆性对应着生物功能的改变，则可以为确定某一残基的可能功能提供一定的证据。如在丙酮酸激酶中精氨酸残基的修饰反应过程中，伴随着精氨酸残基的修饰，酶分子可逆地失活，底物保护作用说明酶分子在底物磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸结合位点具有一个必需的精氨酸残基。

H.Tavakoli等用化学修饰的方法研究了维生素B复合体氧化酶（ChOx）活性部位的组氨酸和丝氨酸的作用。他们用二乙基焦碳酸盐（DEPC）和苯甲基磺酰氟（PMSF）对组氨酸和丝氨酸的残基进行了化学修饰，实验结果表明，组氨酸位于酶的活性中心，而丝氨酸则存在于酶活性中心的附近。

化学修饰能够用于酶变构部位必需氨基酸残基的分析和协同相互作用所必需残基的表征。

3.测定酶分子中某种氨基酸的数量

虽然氨基酸分析法也可以测酶分子中氨基酸的数量，但是如果只需测定某一种氨基酸的数量时，就可以用定量的化学修饰方法，因为这样既快速又灵敏。如用三硝基苯磺酸测定氨基；用对氯汞苯甲酸测巯基等。其他氨基酸残基也有相应的试剂用于定量测定，见表3-1。

化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用除上述三个方面以外，在测定酶的氨基酸序列和研究变构酶时，许多方法也都是以化学修饰为基础的。如胰蛋白酶对精氨酸和赖氨酸具有高度特异性，通常用此酶水解酶分子，以制备肽碎片。为了防止精氨酸和赖氨酸相互干扰，可选择性地化学修饰赖氨酸和精氨酸，使水解局限在其中一种残基的肽键上。

二、化学修饰酶在医药和生物技术中的应用

酶作为生物催化剂，其高效性和专一性是其他催化剂所无法比拟的。因此，愈来愈多的酶制剂已用于疾病的诊断治疗和预防，食品发酵和化工产品的生产，环境保护和监测以及基因工程等生物技术领域。但是酶作为蛋白质，其异体蛋白的抗原性受蛋白水解酶的水解和抑制作用，在体内的半衰期短，不稳定，不能在靶部位聚集，不合适的最适pH等缺点严重影响医用酶的使用效果，甚至无法使用。工业用酶常常由于酶蛋白抗酸、碱和有机溶剂变性能力差，不耐热，容易受产物和抑制剂的抑制，工业反应要求的pH和温度不在酶反应的最适pH和最适温度范围内，底物不溶于水或酶的pK值高等缺点，限制了酶制剂的应用范围。

如何提高酶的稳定性，解除抗原性，改变酶学性质（最适pH，最适温度Km值，催化活性和专一性），扩大酶的应用范围的研究越来越引起人们的重视。分子酶工程（Molecular Enzyme Engineering）可以从分子水平改造酶，弥补天然酶的缺陷，并赋予它们某些新的机能和优良特性。化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。事实证明，只要选择合适的修饰剂和修饰条件，在保持酶活性的基础上，能够在较大范围内改变酶的性质。如在医药方面，化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长它在体内的半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性和抗原性。如今对医用酶的修饰是Landsteiner和Vander Scher的早期工作的发展，他们研究偶联于蛋白质的短肽对抗原特异性的影响，随后Sela等人做了大量的工作，他们通过使用游离的或者与蛋白质结合的合成多肽来阐明免疫反应，他们发现将一定的多聚氨基酸结合到蛋白质上能降低它们的免疫原性和抗原性。在生物技术领域，化学修饰酶能够提高酶对热、酸、碱和有机溶剂的耐性；改变酶的底物专一性和最适pH等酶学性质。化学修饰酶还可以创造新的催化性能。

酶的活性部位是酶进行催化反应之所在。对远离活性部位的氨基酸残基进行化学修饰，做较大的改变，但又不使酶失活是可能的。此外，有的酶需要辅因子，辅因子的改变或转移会使酶的性质发生很大的变化。

1.酶的表面化学修饰

（1）大分子修饰　可溶性大分子，如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸（PAA）、聚氨基酸、葡聚糖、环糊精、乙烯/顺丁烯二酰肼共聚物、羧甲基纤维素、多聚唾液酸、肝素等可通过共价键连于酶分子表面，形成一覆盖层。其中分子量在500～20000范围内的PEG类修饰剂的应用最广，它是既能溶于水又可以溶于绝大多数有机溶剂的两亲分子，它一般没有免疫原性和毒性，其生物相容性已经通过美国FDA认证。PEG分子末端有两个能被活化的羟基，但是化学修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇（MPEG）。

MPEG只带有一个可被活化的羟基，按不同的活化剂，可将MPEG类修饰剂分为：

①MPEG均三嗪类衍生物　这类修饰剂包括MPEG（甲氧基聚乙二醇）和MPEG2（二甲氧基聚乙二醇三嗪），MPEG的羟基与均三嗪即三聚氯氰的氯反应，控制不同的反应条件，可以分别制得活化的MPEG和MPEG2。被三聚氯氰活化的修饰剂引入了活泼的氯，可以与酶的氨基反应。因为MPEG在一个三聚氯氰环上只连一个MPEG分子，MPEG2在一个三聚氯氰环上连两个MPEG分子，所以在氨基修饰程度相同时，MPEG2修饰酶所引进的MPEG分子数是MPEG1的两倍，MPEG2的修饰效果好于MPEG1（图3-13、图3-14）。

②MPEG的琥珀酰亚胺类衍生物　MPEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯（ss-MPEG）、MPEG琥珀酰亚胺琥珀酰胺（SSA-MPEG）、MPEG琥珀酰亚胺碳酸酯（SC-MPEG）等MPEG的琥珀酰亚胺类衍生物可以在pH7～10的范围内修饰酶的氨基。

③MPEG氨基酸类衍生物　MPEG与亮氨酸的α-氨基或赖氨酸上的α-氨基和ε-氨基反应，制备出的MPEG的氨基酸类衍生物可以通过N-羟基琥珀酰亚胺活化。

④蜂巢形MPEG（comb-shaped MPEG）　聚乙二醇与马来酸酐形成的共聚物（PM）具有多个反应位点，呈现蜂巢形结构。已制备出两种活化的PM共聚物：活化PM13（分子量≈100000；m≈50，n≈40，R=CH3）。修饰剂分子中的马来酸酐直接与酶分子上的氨基酸反应形成酰胺键。这些蜂巢形修饰剂将酶分子表面覆盖上一个阴离子基团。

⑤其他PEG衍生物　PEG胺类衍生物可以修饰羰基化合物，还可以作为合成其他修饰剂的中间体。异双功能PEG也可以用来修饰除了氨基以外的其他基团。

修饰剂的性质对修饰结果有很大的影响。我们选用单甲氧基聚乙二醇、右旋糖酐、肝素及小分子乙酸酐对治疗白血病的L-天冬酰胺酶进行了化学修饰。表3-2、表3-3的结果表明，不同的修饰剂可在不同程度上降低抗原性，抗原性的降低与氨基修饰程度存在正相关，氨基修饰程度越高，解除抗原性的效果越好。但是不同分子量的右旋糖酐修饰酶其抗原性的降低和酶活性的减少均与修饰剂分子的大小有关。T70和T40右旋糖酐修饰酶当其氨基修饰程度分别是47.5％和69.8％时，虽然T70修饰酶的修饰程度小于T40修饰酶，但是抗原性降低程度却是前者大于后者。此外，反应pH、温度以及酶与修饰剂的摩尔比也影响修饰程度和修饰酶的性质，其中pH是最重要的条件，一般情况下，增加pH可以提高反应速率。在MPEG修饰反应中，反应pH在8～10之间，温度保持在4～8℃。酶与MPEG的摩尔比一般为1:（3～5），反应时间为8～16h。修饰过程采取底物保护酶活性部位的措施可以减少酶活力的损失。

L-天冬酰胺酶在有底物保护和无底物保护的条件下在半饱和乙酸钠溶液中pH7.5、0℃反应1h，制备乙酸酐修饰酶。比较两种修饰酶的残余活力、氨基修饰程度及抗原-抗体结合能力，发现两种修饰酶在氨基修饰程度和抗原-抗体结合能力相差无几的情况下，底物保护修饰酶的活力却是无底物保护修饰酶的3倍（表3-4）。

L-天冬酰胺酶在有底物保护和无底物保护的条件下用MPEG1和MPEG2修饰，结果见表3-5。由表3-5可见，底物保护下的MPEG1修饰酶和MPEG2修饰酶均比无底物保护下的修饰酶活力高。当MPEG2修饰酶在有底物保护和无底物保护下其氨基修饰分别为51个和52个时，抗原性完全解除，但是酶活力前者却是后者的3倍。

从表3-4及表3-5还可以看出无底物保护的乙酸酐修饰酶和MPEG修饰酶，虽然抗原性有所降低，但是酶活力损失严重。其原因可能是氨基与酶的活性部位有关。在修饰参与抗原决定簇的氨基的同时，无选择地修饰了酶活性部位的氨基，导致酶失活；也可能是修饰了参与维持酶活性部位天然构象的有关氨基，导致酶失活。采用底物保护酶活性部位的方法，可以使与活性相关的氨基不被修饰，而有效地修饰与抗原决定簇有关的氨基，以此达到降低或解除抗原性的同时，尽可能保持酶活力的目的。

除液相修饰法外，还可以采用固相修饰法，即酶吸附在离子交换柱上，在一定时间内PEG修饰剂循环不断地流过柱子。反应结束后，用缓冲液冲洗掉其他副产物和过量的PEG。改变缓冲液中盐的浓度可以将修饰酶洗脱下来。为了保持相同的蛋白浓度，柱子用相同量的未修饰酶再生，PEG再一次循环修饰、洗脱、分离修饰酶。

迄今，已有100多种蛋白质（其中许多是酶）被修饰后在临床应用中显出许多优良的特性。如稳定性提高；体内半衰期延长；免疫原性和毒性降低或消除；提高膜渗透性；改善在体内的生物分布与代谢行为，提高疗效；增加在有机溶剂中的溶解度和耐有机溶剂变性的能力等。

聚乙二醇、右旋糖酐、肝素等可溶性大分子制备的修饰酶具有许多有利于应用的新性质。如，聚乙二醇修饰的天冬酰胺酶不仅可降低或消除酶的抗原性，而且可以提高酶的抗蛋白水解的能力，延长酶在体内的半衰期，提高药效。L-天冬酰胺酶（L-asparaginase）（EC3.5.1.1）具有较强的抗肿瘤作用。它能将肿瘤细胞生长所需的L-天冬酰胺水解为天冬氨酸和氨，从而特异并有效地抑肿瘤细胞的恶性生长。目前，大肠杆菌L-天冬酰胺酶作为治疗淋巴性白血病、恶性淋巴肿瘤的酶制剂已在国外应用于临床，并且是治疗急性淋巴性白血病治疗指数最高的药物。但由于它来源于微生物，对人而言是一种外源性蛋白，有较强的免疫原性，临床上常见进行性免疫反应和全身性过敏反应，限制了其临床应用。近年来，许多研究结果表明，用聚合物修饰能较好地克服这些缺陷。目前主要采用PEG和右旋糖酐这两种修饰因子进行修饰。人体血浆中含有少量的蛋白酶，能使外源性L-天冬酰胺酶逐渐水解失活。只有当L-天冬酰胺酶具有较强的抗蛋白酶水解作用时，它才能在人体内停留较长的时间，起到抗癌作用。L-天冬酰胺酶经修饰后，与天然酶相比具有较强的抗蛋白酶水解能力。当羧甲基壳聚糖的平均分子量大于1×104时，L-天冬酰胺酶经修饰后可以降低其抗原性，且分子量越大降低抗原性的效果越好。这是由于IgG抗体可以在蛋白表面的多糖链中移动而与蛋白起抗原抗体反应。将天然酶和羧甲基壳聚糖修饰的L-天冬酰胺酶分别静注至新西兰白兔体内，在一定时间间隔取血检测，天然酶和修饰酶在血浆中的清除基本上满足一级动力学反应，其半衰期分别为1.2h和40h，修饰酶比天然酶提高了33倍。

PEG修饰的腺苷脱氨酶经腹腔注射后，在血液循环中可以测出50％的酶活力，而且这种酶活力在血液循环中可以保留72h，相反，注射天然腺苷脱氨酶后，在血液循环中最多可测出只有7％的酶活力，而且在2h以内被清除。

多聚物修饰酶，可能提高在生理pH条件酶活力很低的某些医用酶的医疗价值。如色氨酸分解酶和3-烷基吲哚α-羟化酶有抗肿瘤的活性，由于它的最适pH是3.5，所以限制了它的临床应用。Schmer和Roberts用聚丙烯酸或聚顺丁烯二酸修饰这种酶，使其最适pH向中性提高，结果使其在pH7.0的活力增加了3倍。

超氧化物歧化酶（SOD）是一类广泛存在于生物体内的金属酶，它具有抗衰老和消炎的效果，但是由于它有半衰期短和异体蛋白抗原性的缺点，限制了其临床应用。PEG修饰超氧化物歧化酶活性保持51％，在血液中的停滞时间延长，抗炎活性提高。SOD和低抗凝活性肝素（low anticoagulant activity heparin，LAAH）都具有抗炎作用，并且肝素可以提高外源性SOD在体内的作用。用溴化氰活化LAAH对SOD进行化学修饰，通过Sephadex G-75很好地将修饰酶与天然酶分离。LAAH经修饰反应后，其己糖醛酸、氨基己糖、总硫酸基和抗凝血活性均降低；而修饰后的SOD的抗原性明显降低。重组人铜锌SOD制品仍存在半衰期短的问题。化学修饰是解决这一问题的有效方法，如聚苯乙烯马来酸丁酯（SMA）作为修饰剂，将SMA的二甲基亚砜（DMSO）溶液滴加于rh Cu/Zn SOD硼酸钠溶液（0.5mol/L，pH8.0）中，SMA与rh Cu/Zn SOD的摩尔比为10:1。该体系在37℃水浴中振摇反应1h，于不同时间取样监测SOD活性及交联度。随着修饰剂用量的增大，修饰程度加大，残留酶活力降低。由于参与交联反应的基团为酶分子中非活性部位赖氨酸残基的ε-NH2，检测也显示，交联前后酶蛋白主链结构改变不大，因此推测导致酶活力降低的主要原因是空间位阻效应。实验中还发现修饰程度对半衰期长短有影响，所以为了获得具有较高残留酶活力和较长生物半衰期的修饰酶，选择适当的修饰剂浓度是至关重要的。在大鼠实验中测得修饰酶的生物半衰期约为3.7h，为修饰前的22倍。

酶的化学修饰被认为是寻找新型的生物催化剂的一个有效的工具。如辣根过氧化物酶用MPEG共价修饰后，在极端pH条件下抗变性能力提高，耐热性也有所增加。用右旋糖酐修饰α-淀粉酶、β-淀粉酶、胰蛋白酶和过氧化氢酶有效地提高了酶的热稳定性。α-淀粉酶在60℃ t1/2是3.5min，用右旋糖酐修饰后增加到175min。用右旋糖酐修饰胰蛋白酶，不仅增加了热稳定性，而且也使自水解降低。该酶右旋糖酐修饰后在pH8.1、37℃保温2h，活力没有丧失，而未修饰酶则丧失85％的活力。化学修饰酶热稳定性提高的原因可能是由于修饰剂共价连接于酶分子后，使酶的天然构象产生一定的“刚性”，不易伸展失活，并减少了酶分子内部基团的热振动。而且这种稳定化效果与酶和修饰剂之间交联点的数目有关。PEG和酶以单点交联时热稳定性提高不明显。过氧化氢酶用右旋糖酐修饰后能保持100％的酶活力，这可能是因为这个酶的底物很小，它不能被结合的多聚物修饰剂所阻碍，能很容易地进入酶的活性部位。右旋糖酐修饰的过氧化氢酶表现出较高的热稳定性，在52℃ 10min酶活丧失10％，而未修饰酶则丧失60％的活力。修饰酶的失活温度比天然酶高得多。但是PEG修饰的过氧化氢酶热稳定性与未修饰酶比几乎没有改变，在不同的温度下两者都表现出非常相近的活力，失活温度也没有改变。这是因为一个单一的右旋糖酐分子上有多个结合位点，而PEG只有一个结合位点，它与酶不能发生多位点结合。增加交联点的方法是制备与酶分子表面互补的聚合物，即先用单体类似物修饰酶表面，然后再与单体共聚合，则可实现酶与聚合物的多点交联，使酶的稳定性明显提高。MPEG共价修饰的过氧化氢酶在有机溶剂中的溶解性和酶活性也得到提高，在三氯乙烷中酶活是天然酶的200倍，在水溶液中酶活是天然酶的15～20倍。荧光假单胞菌脂肪酶偶联于MPEG后，可溶于苯中，修饰酶在苯中的储存稳定性很好，140d后仍有原酶合成活力的40％，而且酯交换的最适温度为70℃，大大高于未修饰脂肪酶在水乳相中催化酯水解的最适温度。念珠菌属脂肪酶（CRL）修饰后（图3-15），在异辛烷中的稳定性和活性提高许多。脂肪酶和蛋白酶被MPEG修饰后，可溶于有机溶剂，并具有催化酯合成、酯交换和肽合成的能力。

（2）小分子修饰　利用小分子化合物对酶的活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰，以改变酶学性质。已被广泛应用的小分子化合物主要有氨基葡萄糖、醋酸酐、硬脂酸、邻苯二酸酐、醋酸-N-丁二酯亚胺酯、辛二酸-二-N-羟基丁二酰亚胺酯［suberic acid bis（N-hydroxy succinimide ester）］等。未糖基化的核糖核酸酶A与D-葡萄胺进行化学偶联，得到单糖基化酶和双糖基化酶（图3-16）。其中，53位的天冬氨酸和49位的谷氨酸被认为可能是糖基化位点。经过修饰的单糖基化核糖核酸酶A的活力比天然酶降低80％，但是热稳定性大大提高。CRL经二己基-对-硝基-磷酸苯酯化学修饰后，改变了水解酶的特性。

K.Sangeetha等选用几种酸酐对木瓜蛋白酶进行了化学修饰，这些酸酐与酶分子中5～6个赖氨酸残基发生了反应，使酶分子的净电荷由正变为负，同时，酶分子的最适pH由7变为9，最适温度由60℃变为80℃，而且修饰后的酶具有较高的热稳定性。这些酶学性质的改变使木瓜蛋白酶更加适用于洗涤剂应用领域。

氧化还原酶中的谷胱甘肽过氧化物酶是不稳定的，但人们对它很感兴趣。通过使用化学修饰的方法，用不稳定的氧化型硒原子取代胰蛋白酶中195位丝氨酸γ位的氧原子，将胰蛋白酶转变为硒代胰蛋白酶（图3-17），硒化胰蛋白酶失去了还原酶的活性，而表现出较强的谷胱甘肽过氧化物酶的活性。它催化谷胱甘肽的氧化还原反应：

用亚硝酸修饰天冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸和肽链中的赖氨酸残基上的氨基产生脱氨基作用，变成羟基。经过修饰后，酶的稳定性大大提高，使其在体内的半衰期延长2倍。α-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的—NHCH2COOH后，该酶抗不可逆热失活的稳定性在60℃可提高1000倍。在更高温度下稳定化效应更强。这种稳定的酶能经受灭菌的极端条件而不失活。马肝醇脱氢酶（HLADH）的Lys的乙基化、糖基化和甲基化都能增加HLADH的活力。其中甲基化使酶活力增加最大，同时酶稳定性也提高许多。更有意义的是，糖的手性影响糖基化酶的性质，糖基化酶和甲基化酶的底物专一性有所改变，这种操纵底物专一性的能力在立体专一性有机合成中特别有用。共价修饰酶稳定化的原因有：①修饰后有时会获得不同于天然蛋白质构象的更稳定的构象；②由于修饰“关键功能基团”而达到稳定化；③由化学修饰引入到酶分子中的新功能基可以形成附加氢键或盐键；④用非极性试剂修饰可加强酶蛋白分子中的疏水相互作用；⑤蛋白质表面基团的亲水化。

酶的化学修饰也在生物传感器方面发挥越来越大的作用。酶作为一类典型的生物大分子和特殊的催化剂，在生命过程中扮演着极其重要的角色。尤其是在呼吸链中生物氧化和新陈代谢是靠多种酶的共同作用才完成的，研究酶的直接电化学无论是在理论上还是在实用上都具有重要的意义。在理论上，酶与电极之间直接的电子传递过程更接近生物氧化还原系统的原始模型，这就为揭示生物氧化还原过程的机制奠定了基础。另外，酶直接电化学的研究可望为推断澄清生物氧化还原系统中电子传递反应的特异性提供一定的依据。从应用方面而言，酶直接电化学的实现可用于研制第三代生物传感器和发展人工心脏用的生物燃料电池。Degani和Heller等提出了通过化学修饰酶形成电子转移中继体（electron-transfer relays），便可缩短电子隧道距离，从而实现酶的直接电化学。他们将二茂铁衍生物共价连接到GOD和D-氨基酸氧化酶（AOD）上。从而获得了这些酶在铂或金电极上的直接电化学，证明其设想可行。此后又发现了［Ru（NH3）5H2O］2+也可修饰到酶分子上形成有效的电子转移中继体。微酶电极具有电极端径小，反应具有高度的专一性和催化性，可以测定多种生化物质和有机物质等优点，现已成为生物传感器研究领域中的热点。由于葡萄糖在生物体内的作用重大，医学领域对发展微型葡萄糖生物传感器研究的需求在不断增加。用铂、碳纤维为基体电极的葡萄糖微型生物传感器的报道较多。而用碳糊为基体电极制作微酶传感器，制作方法简单。但由于碳糊颗粒本身体积较大，很难做成端径很小的微电极，所以该类微酶电极的报道很少。Shea等利用碳糊-二甲基二茂铁-葡萄糖氧化酶（GOD）制作了微酶电极。

（3）反相胶束修饰　反相胶束是由两性化合物在占优势的有机相中形成的。根据溶剂和表面活性剂的组成，可在与水不混溶的溶剂中得到微乳化的反相胶束。反相胶束提供了包埋酶的口袋，使酶微囊化，可以保护酶，使其能在不利环境下有效地发挥作用。反相胶束还能提高酶活力，改变酶的专一性。例如，包埋在由SDS和苯等组成的反相胶束中的蔗糖酶的活力比其在水介质中的活力高4倍多，而且维持活力的时间由48h延长至4d。

2.酶分子内部修饰

对酶工程而言，酶化学修饰的目的是系统改变酶的专一性，改变酶作用的最适pH，改变底物抑制和活化的形式，甚至改变酶催化反应的类型。已有一些动力学性质发生改变的例子，也有一些引入新催化活力的例子，修饰结果不可预测。但现在，借助X射线结晶学和计算机图示技术有可能以和药物设计大致相同的方式，原则上设计修饰剂，而且随着今后用蛋白质工程法修饰酶，而对蛋白质结构理解的增加，也应当有可能预测有限化学修饰的效应。

（1）非催化活性基团的修饰　最经常修饰的残基既可是亲核的（Ser，Cys，Met，Thr，Lys，His），也可是亲电的（Tyr，Trp），或者是可氧化的（Tyr，Trp，Met）。对这类非催化残基的修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。研究得较充分的例子是胰凝乳蛋白酶。将此酶Met-192氧化成亚砜，则使该酶对含芳香族或大体积脂肪族取代基的专一性底物的Km提高2～3倍，但对非专一性底物的Km不变，这说明对底物的非反应部分的束缚在酶催化作用中有重要作用。

（2）蛋白主链的修饰　迄今，主链修饰主要靠酶法。将猪胰岛素转变成人胰岛素就是一个成功的例子。猪和人的胰岛素，仅在B链羧基端有一个氨基酸的差别。用蛋白水解酶将猪胰岛素B链末端的Ala水解下来，再在一定条件下，用同一酶将Thr接上去，即可将猪胰岛素转变成人胰岛素。丹麦的Novo公司仅用两年的时间，就把这项成果扩展到工业生产中。

用胰蛋白酶对天冬氨酸酶进行有限水解切去10个氨基酸后，酶活力提高5.5倍。活化酶仍是四聚体，亚单位分子量变化不大，说明天然酶并不总是处于最佳构象状态。

（3）催化活性基团的修饰　酶学家的梦想之一是能任意改变酶的氨基酸顺序。蛋白质工程的出现已使这个梦想变成现实。然而，通过选择性修饰氨基酸侧链成分来实现氨基酸取代更为简捷。这种将一种氨基酸侧链化学转化为另一种新的氨基酸侧链的方法叫做化学突变法。这种方法显然受到是否有专一性修饰剂及有机化学的工艺水平的限制。尽管如此，Bender等人还是成功地将枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转化为半胱氨酸残基。新产生的巯基枯草杆菌蛋白酶对肽或酯没有水解活力，但能水解高度活化的底物如硝基苯酯。进行过化学突变的酶有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，但突变后的酶都没有活力。有用的修饰要求保持酶的催化活力。修饰前，保护酶的活性部位是可行的办法。对胰凝乳蛋白酶的修饰就采取了这种办法。这里显然有潜力。虽然化学修饰所获得的花样，由于可用试剂的限制，没有蛋白质工程法来得多，但可进一步研制有用的试剂。例如，羟胺-O-硫酸酯是万能的胺化试剂，在水溶液中也有效。胺化反应可以把疏水氨基酸突变成非天然碱性氨基酸。光化学可能产生更成熟的修饰。另外，通过巴顿反应可以将反应性引入蛋白质中。总之，化学修饰通过它的产生非蛋白质氨基酸的能力，可以有力地补充蛋白质工程技术的不足。

（4）与辅因子相关的修饰

①对依赖辅因子的酶可用两种方法进行化学修饰。第一，如果辅因子与酶的结合不是共价的，则可将辅因子共价结合在酶上。将NAD衍生物共价结合到醇脱氢酶上后，酶仍具有催化活性构象。活力大约是使用过量游离NAD时活力的40％，而且能抵抗AMP的抑制。这是解决合成中昂贵的辅因子再循环问题的重要进展。第二，引入新的或修饰过的具有强反应性的辅因子。巯基专一试剂能改变某些依赖黄素的氧化酶所催化的反应。例如，用disulphiram处理黄嘌呤脱氢酶，可将其转化为黄嘌呤氧化酶。这类为某一反应而使化合物的氧化作用发生改变，在经济上颇具吸引力。

②最有创造性的修饰方法是将新的辅酶引入结构已弄清的蛋白质上。这要求对辅酶本身的化学结构要有清楚的了解。在实验上则是如何让辅酶更好地适应新的环境。迄今最好的例子是Kaiser的黄素木瓜蛋白酶。黄素的溴酰衍生物可与木瓜蛋白酶的Cys-25共价结合成为黄素木瓜蛋白酶，其动力学行为可与老黄酶相比拟。这类半合成酶的开发虽然刚开始，但已可预见其许多的实际应用。酚类的羟化和硫醇酯立体专一性地氧化成手性亚砜，都可用依赖黄素的半合成酶来完成。用黄素血红蛋白可以模拟细胞色素P450的某些有意义的化学性质。半合成酶的优点来自它的多样性。只要简单地改变蛋白质模板，就可能调节反应的底物专一性和立体选择性。利用半合成酶还可获得关于蛋白质结构和催化活性间的详细信息，最终，这些信息可用于构建更有效的第二代、第三代催化剂。其他的辅酶，如维生素B1、吡哆醛、卟啉、酞菁，甚至金属离子都可以加入到蛋白质的束缚部位，产生新的实用催化剂。

Kaiser等人证明利用辅助因子与酶进行共价结合可以产生新的酶活性。最近，使用固相合成技术，将核糖核酸酶S的C肽链中第8残基苯丙氨酸用一种天然氨基酸——磷酸哔哆胺（维生素B6）取代。经过化学修饰重新构成的核糖核酸酶S催化反应的速率提高7倍。

许多酶都含有辅酶或辅基，这些基团都是酶的活性基团。由于种类有限，限制了酶的功能。如果能够利用化学方法在这些基团中接上一些辅因子，再经修饰，便可创造出多种多样的新型酶。

③金属酶中的金属取代。酶分子中的金属取代可以改变酶的专一性、稳定性及其抑制作用。例如，酰化氨基酸水解酶活性部位中的锌被钴取代时，酶的底物专一性和最适pH都有改变。锌酶对N-氯-乙酰丙氨酸的最适pH是8.5，而钴酶的最适pH是7.0；钴酶对N-氯-乙酰蛋氨酸等三种底物的活力降低。因此，在使用上，对不同的底物可选用锌酶与钴酶。

天然含铁超氧化物歧化酶中的铁原子被锰取代后，酶的稳定性和抑制作用发生显著改变；重组含锰酶对H2O2的稳定性显著增强，对NaH3的抑制作用的敏感性显著降低。虽然金属酶中活性部位上的金属交换这一修饰技术尚处于幼年时期，但上述例子足以说明这种技术在实用上的巨大意义，应当给予足够的重视。

（5）肽链伸展后的修饰　为了有效地修饰酶分子的内部区域，Mozhaev等提出，先用脲或盐酸胍处理酶，使酶分子的肽链充分伸展，这就提供了化学修饰酶分子内部疏水基团的可能性。然后，让修饰后的伸展肽链，在适当的条件下，重新折叠成具有某种催化活力的构象。遗憾的是，到目前为止，这只是一个想法，还没有成功的例子。然而十分有意义的是，他们用这种构象重建法，使不可逆热失活的固定化胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶重新活化，活力基本上完全恢复到酶失活前的水平，而且这种热失活-重新活化的过程可连续重复四次之多。这种失活酶的再活化，显然具有重大的经济效益。

Saraswathi等描述了一种新奇的原则上可能普遍适用的改变酶底物专一性的方法。先让酶变性，然后加入相应于所希望的活性构象时，用戊二醛交联。他们用丙酸作竞争性抑制剂，从核糖核酸酶出发，制得一种“酸性酯酶”，从而改变了酶的底物专一性，创造了新的酶活力。

综上所述，可以清楚地看出酶化学修饰在酶工程中显示的潜力。显示潜力的最好证明是，酶修饰开发了新反应。下面的例子更能说明简单化学修饰的威力。许多重要的生物活性肽含有D-氨基酸。由于肽酶对L-氨基酸酯正常底物的专一性，因此不可能在肽酶的催化作用下合成含D-氨基酸的肽，但是，如果将胰凝乳蛋白酶上的Met-192修饰成亚砜则可使这类反应能够实际应用来修饰酶没有催化肽合成的能力，而修饰酶在合成Z-L-Tyr-D-Met－Ome中的活力保持92％，收率为80％。

3.结合定点突变的化学修饰

通过一些可控制的方法在酶或蛋白质的特殊位点引入特定的分子来修饰酶或蛋白质，结合定点突变引入一种非天然氨基酸侧链来进行化学修饰，从而得到一些新颖的酶制剂。它的策略是利用定点突变技术在酶的关键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰法将突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化合物，得到一种称为化学修饰突变酶（chemically modified mutant enzyme，CMM）的新型酶。DeSantis G等利用定点突变法在Bacillus lentus枯草杆菌蛋白酶（SBL）的特定位点中引入半胱氨酸，然后用甲基磺酰硫醇（methanethiosulfonate）试剂进行硫代烷基化，得到一系列新型的化学修饰突变枯草杆菌蛋白酶（图3-18）。酶的kcat/Km值随疏水基团R的增大而增大，而且绝大部分CMM的kcat/Km值都大于天然酶，有些甚至增加了2.2倍。因此，CMM能够改进酶的专一性及扩大催化底物的范围。

三、酶化学修饰的局限性

①某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。因为同一种氨基酸残基在不同酶分子中所存在的状态不同，所以同一种修饰剂对不同酶的修饰行为也不同。

②化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，因此，这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。但是，如果在实验中控制好温度、pH等实验条件，选择适当的修饰剂，这个问题可以得到解决。

③酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，但是X射线衍射结构分析结果表明，其他氨基酸侧链在维持酶的空间构象方面也有重要的作用，而且从种属差异的比较分析，它们在进化中是比较保守的。目前还不能用化学修饰的方法研究这些氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。

④酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需”的，为什么是必需的，还得用X射线和其他方法。因此，化学修饰法研究酶结构与功能的关系尚缺乏准确性和系统性。

⑤酶化学修饰的修饰率受反应进程的影响比较大，因此，不同批次制备的修饰酶存在性质和品质上的差异，不像酶表达的产物，因此，对于修饰酶的大规模生产是个问题。严格控制酶修饰条件和修饰方法以及修饰剂的品质将在一定程度上减少这种差别。