第四节　影响非水介质中酶催化的因素以及调控策略

在有机溶剂中酶的催化活性和选择性与反应系统的水含量、有机溶剂的性质、酶的使用形式（固定化酶、游离酶、化学修饰酶、酶粉干燥前所在缓冲液的pH和离子强度等因素）密切相关。控制和改变这些因素，可以提高有机溶剂中的酶活性，调节酶的选择性。蛋白质工程和抗体酶技术也是改变酶在有机介质中的催化活性、稳定性和选择性的重要手段。

一、有机溶剂

有机溶剂对酶催化活力的影响是非水酶学所要阐明的重要因素，溶剂不但直接或间接地影响酶的活力和稳定性，而且也能够改变酶的特异性（包括底物特异性、立体选择性、前手性选择性等）。通常有机溶剂通过与水、酶、底物和产物的相互作用来影响酶的这些性质。

1.有机溶剂对酶的结合水的影响

虽然一些有机溶剂对酶的结合水影响较小，但一些相对亲水性的有机溶剂却能够夺取酶表面的必需水，从而导致酶的失活。Dordick等测定了分散于各种有机溶剂中的酶（胰凝乳蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶及过氧化酶）释放水的情况，他们发现所有的酶均会在这些溶剂中发生水的脱附现象。酶失水的情况与溶剂的极性参数（1/ε）和疏水性参数（logP）有关。例如甲醇能够夺取60％的结合水而正己烷却只能夺取0.5％的结合水。由于酶与溶剂竞争水分子，体系的最适含水量与酶的用量及底物浓度也有关。Stevenson对木瓜蛋白酶催化的酯合成反应进行了研究，发现最适含水量与溶剂的logP有良好的线性关系。这也进一步证明了有机相中酶的活力主要取决于由酶的结合水与有机溶剂的相互作用。

增加酶表面的亲水性可以限制酶在有机溶剂中的脱水作用。例如，将α-胰凝乳蛋白酶用（1，2，4，5）-苯四二酸酐（pyromellitic dianhydride）共价修饰后，酶在有机溶剂中的稳定性明显地提高了。

2.有机溶剂对酶分子的影响

（1）溶剂对酶结构的影响　尽管酶在有机溶剂中整体结构以及活性中心的结构都保持完整，但是酶分子本身的动态结构及表面结构却发生了不可忽视的变化。例如，过氧化物酶内部色氨酸的荧光在有二氧六环存在时与游离的L-色氨酸在二氧六环中的荧光相似，说明酶在二氧六环中有所失活。在水-2，3-丁二醇中，α-胰凝乳蛋白酶也发生变性，这可以从荧光强度和最大发射波长的变化而看出。

（2）溶剂对酶活性中心的影响

酶的活性中心是酶发挥催化功能的主要部位，任何对活性中心的微扰都将导致酶的催化活性的改变。Affleck等观察到的活性中心柔性的改变而导致的酶活力的变化就是比较直观的说明。溶剂对酶的活性中心的影响主要是通过减少整个活性中心的数量。活性中心的数目可以通过活性中心滴定的方法测得。例如，在水溶液中α-胰凝乳蛋白酶的活性中心浓度并不受有机溶剂的影响，但当悬浮在辛烷中时，可催化的活性中心数量只剩下2/3。后来的研究结果证明，活性中心数目的减少并不完全是由有机溶剂造成的。固态NMR的结果表明，冻干过程所造成的活性中心的丧失约占整个活性中心损失的42％，而溶剂则造成另外0～52％的丧失，活性中心数目丧失的多少取决于溶剂的疏水性大小。例如，辛烷与二氧六环分别会造成0％和29％的活性中心的丧失。这种由于溶剂而导致的酶活力的丧失可能是由于酶脱水或蛋白质去折叠造成的。虽然这可以用来解释为什么在有机溶剂中酶活力要低于水中的酶活力，但目前仍不清楚酶活力的丧失是否是由于蛋白质分子的运动性降低造成的。溶剂对酶分子活性中心影响的另一种方式是与底物竞争酶的活性中心结合位点，当溶剂是非极性时，这种影响会更明显，而且溶剂分子能渗透入酶的活性中心，降低活性中心的极性，从而增加酶与底物的静电斥力，因而降低了底物的结合能力。这种竞争抑制能够解释当底物与酶一起在有机溶剂如二烷和乙腈中时Km值的增加。

3.溶剂对底物和产物的影响

溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用，影响酶的活力。溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓度，而底物必须渗入必需水层，产物必须移出此水层，才能使反应进行下去。Yang等对这种影响进行了较为深入的研究，他们发现溶剂对底物和产物的影响主要体现在底物和产物的溶剂化上，这种溶剂化作用会直接影响到反应的动力学和热力学平衡。曹淑桂等在脂肪酶催化酯合成的实验中发现，该酶在十二烷（lgP=6.6）中的活力只达到苯（lgP=2）中酶活力的57.5％，酶在2.0≤lgP≤3.5范围内的溶剂中活力较高。这并不完全符合上述的Laane等人提出的酶活性与lgP之间的规律。这可能是由于溶剂的疏水性强，使疏水底物不容易从溶剂中扩散到酶分子周围，导致酶活性低。

4.溶剂对酶活性和选择性的调节和控制（溶剂工程，solvent engineering）

精巧的选择性可以说是酶催化的特征标志。许多文献报道，当从一种溶剂中换到另一种溶剂中时，酶的各种选择性（包括底物选择性、区域选择性、化学选择性、对映选择性和潜手性选择性等）都会发生深刻的变化。

底物选择性是指酶辨别两种结构相似底物的能力，这常常是基于两种底物之间疏水性的差别。例如，许多蛋白酶（如枯草杆菌蛋白酶和α-凝乳蛋白酶）与底物结合的主要驱动力来自于氨基酸底物的侧链与酶活性中心之间的疏水作用。因此，疏水性的底物比亲水性的底物反应性更强，因为疏水性底物的驱动力更大。但当水被一种有机溶剂代替时（疏水作用不再存在），上述情形将发生显著的变化。实验表明，疏水性底物N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯（N-Ac-L-Phe-OEt）在水中对α-凝乳蛋白酶的反应性比亲水性底物N-乙酰-L-丝氨酸乙酯（N-Ac-L-Ser-OEt）高5万倍，而在辛烷中苯丙氨酸底物的反应性反而只有丝氨酸底物反应性的1/3。此外，在二氯甲烷中枯草杆菌蛋白酶对N-Ac-L-Phe-OEt的反应性比对N-Ac-L-Ser-OEt的反应性高8倍，而在叔丁胺中情况刚好相反。这种底物选择性明显依赖于溶剂的情形也可见于上述两种酶与其他底物的反应。

酶的区域选择性和化学选择性也受到溶剂的控制。区域选择性是指酶对底物分子中几个相同官能团中的一个具有优先反应能力，化学选择性是指酶对底物分子中几个不同官能团之一的偏爱程度。例如，洋葱假单胞菌脂肪酶（PCL）对一种芳香族化合物中两个不同位置的酯基，或者对糖分子中不同位置的羟基的选择性受到溶剂的深刻影响。又如，许多脂肪酶和蛋白酶在催化氨基醇的酰化反应时，对羟基和对氨基的优先选择性也在很大程度上取决于溶剂的选择。

从合成化学的观点来看，酶的几种选择性的类型中应用价值最大的是立体选择性，尤其是对映选择性和潜手性选择性。遗憾的是，酶在一些非天然的、但却有实用价值的重要转化反应中常表现出立体选择性不够理想，使人们不得不费力费时地进行筛选。因此，当科学家们发现溶剂可以显著影响甚至逆转酶的对映选择性和潜手性选择性后，便为酶的筛选找到一种有前途的替代方法。例如，α-凝乳蛋白酶催化医药上重要的化合物3-羟基-2-苯基丙酸甲酯与丙醇转酯化反应的对映选择性在不同的溶剂中的变化幅度达20倍，而且在一些溶剂中优先选择底物的（S）-对映体，在另一些溶剂中却优先选择（R）-对映体。同样的，当α-凝乳蛋白酶在异丙醚或环己烷中催化潜手性底物2-（3，5-二甲氧苯基）-1，3-丙烷二醇的乙酰化时，优势产物是（S）-单酯，而在乙腈和乙酸甲酯中优先生成（R）-单酯。以上结果不仅具有普遍性和合理性，而且可以根据不同手性或前手性底物与酶结合形成过渡态时的去溶剂化能量学，进行定量或半定量的理论计算。

迄今为止，关于溶剂影响酶的选择性的例子最有说服力的要数日本Amano公司的Yoshihiko Hirose及其合作者对硝苯地平的研究。硝苯地平是1-取代的二氢嘧啶单酯或双酯，用于心血管疾病的治疗，被称为钙拮抗剂。Y Hirose等人通过研究发现，假单胞菌脂肪酶催化潜手性二氢吡啶二羧基酯类衍生物选择性水解产生二羧酸单酯。在不同的有机溶剂中，酶具有不同的对映体选择性，在环己烷中产生（R）-对映体，在异丙醚中产生（S）-对映体，相同酶在不同有机溶剂体系中反应所得产物的构型不同。这种拆分已在钙拮抗剂尼群地平的合成中得到应用。

目前尽管溶剂对酶活性和选择性的影响规律和机制并不十分清楚，但是大量的实验结果表明，通过改变溶剂可以调节酶的活性和选择性，改变酶的动力学特性和稳定性等酶学性质。Klibanov首次称这种技术为“溶剂工程”，并认为它有可能发展成蛋白质工程的一种辅助方法，不必改变蛋白质本身，而只要改变反应介质就可以改变酶的特性。这项技术的应用范围及机制的研究，目前正在许多实验室中开展，它在生物催化剂的开发与利用中将起着重要的作用。当然溶剂的选择还应该注意：①溶剂对底物和产物的溶解性要好，能促进底物和产物的扩散，防止由于产物在酶分子周围的积累而影响酶的催化反应；②溶剂对反应必须是惰性的，不参与酶的催化反应；③溶剂的毒性、成本以及产物从溶剂中分离、纯化等问题。

二、水

大量的文献报道表明，在有机溶剂中酶的催化活性与反应系统的含水量密切相关。系统的含水量包括与酶粉水合的结合水，溶于有机溶剂中的自由水以及固定载体和其他杂质的结合水。与酶结合的水量是影响酶的活性、稳定性以及专一性的决定因素。要成功地应用非水介质中的酶催化反应，控制酶结合的水量和水在酶分子中的位置是关键。在基本无水的有机溶剂中，水对于酶催化活性构象的获得与保持是必需的，但水也与许多酶的失活过程有关。

1.水对酶活性的影响

虽然水含量在一个典型的非水酶体系中通常只占0.01％，但水含量微小的差别会导致酶催化活力的较大改变。酶需要少量的水保持其活性的三维构象状态，即使是共价键合到一个支持物上的酶也不例外。水影响蛋白质结构的完整性，活性位点的极性和稳定性。酶周围水的存在，能降低酶分子的极性氨基酸的相互作用，防止产生不正确的构象结构。有证据表明，酶分子周围的水化层作为酶表面和反应介质之间的缓冲剂，它是酶微环境的主要成分。有机溶剂和酶键合水之间的相互作用影响酶的活性，当加入许多极性添加剂时，因剥夺了酶的水化层而使非水介质中的酶失活。在一个完全“干”的体系中，酶基本是无活性的，随着酶水合程度的增加，酶的活性也不断提高。

Rupley和Finney用UV、IR、NMR、ESR、Raman、DSC等方法详细地研究了溶菌酶酶粉在水合过程中酶活性与酶含水量间的关系。当结合水量在0～7％的范围时每一酶分子周围有0～60个水分子，这些水分子大部分在蛋白质侧链可离子化残基附近，有助于侧链残基的离子化。首先是羧基脱质子，其次是氨基质子化。这种状态下蛋白质活动的自由度非常小，没观察到活性。当含水量在7％～25％的范围时，每个酶分子周围有60～220个水分子。含水量在7％左右时，侧链残基离子化后，水分子在其他极性部位形成簇（cluster）；含水量在25％时，肽键的NH被水合，局部介电率升高，同时蛋白质分子的活动自由度急剧增大，但是蛋白质结构基本不变，构象基本相同，酶显示活性；当含水量在25％～38％的范围时，每个酶分子周围有220～300个水分子，肽键羧基为主的极性部位完全水合，酶活性随着含水量的增加而增加。这是因为水和酶分子之间形成多个氢键，水作为分子润滑剂增大了酶构象的柔性，增加了界面的表面积。然而，太多的水会使酶的活性降低。当含水量在38％以上时，每个酶分子周围有300个以上的水分子，整个酶分子（包括非极性部位）被一层单分子水层包围，酶活性是水溶液中的1/10。其中一个原因是水分子在活性位点之间形成水束，通过介电屏蔽作用，掩盖了活性位点的极性；另一个原因是太多的水会使酶积聚成团，导致疏水底物较难进入酶的活性部位，引起传质阻力。有机溶剂中酶的含水量低于最适水含量时酶构象过于“刚性”而失去催化活性；含水量高于最适水量时，酶结构的柔性过大，酶的构象将向疏水环境下热力学稳定的状态变化，引起酶结构的改变和失活。只有在最适水量时蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性之间达到最佳平衡点，酶表现出最大活力。因此，最适水量是保证酶的极性部位水合、表现活力所必需的，即“必需水”。由于水的高介电性，有机溶剂中少量的必需水能够有效地屏蔽有机溶剂与酶蛋白表面某点之间的静电相互作用，酶分子的构象与结晶状态一致，即与水溶液中酶的结构类似。只有当溶剂的极性非常强，水的介电能力不足以屏蔽溶剂与酶蛋白分子之间的静电相互作用，或者溶剂的亲水性大于与水相互作用的蛋白质表面的亲水性，水脱离蛋白质。进入有机溶剂时，酶蛋白分子的结构才会受到溶剂的影响。当水加入到溶剂-酶体系中时，水在溶剂和酶之间分配，与酶紧密键合的结构水是决定酶活性的关键因素，在有机介质中，只要有少量的水与酶结合，那么酶就会保持其活性。但是有时在脱水的酶体系中也观察到了酶的活性，这可能是由于未折叠的蛋白质充当了少量天然酶的稳定剂而产生的结果。

2.水活度（activity of water，aw）

当水加入到非水酶催化的反应体系中时，反应系统的含水量分布在酶、溶剂、固定化载体及杂质中。因此，对同一种酶，反应系统的最适水含量与有机溶剂的种类、酶的纯度、固定化酶的载体性质和修饰剂的性质有关。Zaks和Klibanov比较详细地研究了马肝醇脱氢酶、酵母醇氧化酶和蘑菇多酚氧化酶在不同溶剂中水含量对酶活力的影响。发现在水的溶解度范围之内三种酶在有机溶剂中的催化活力随溶剂中水含量的增加而增加。但与亲水有机溶剂相比，在疏水性强的溶剂中酶表现最大催化活力所需要的水量低得多；当溶剂的含水量相同时，酶束缚的水量却不同，酶活性与酶束缚水量之间有很好的相关性，即随着酶束缚水量的增加而增大。在不同溶剂中酶活性对酶束缚水量的依赖是相似的而系统含水量则变化很大。

为了排除溶剂对最适含水量的影响，Halling建议用反应系统的热力学水活度（Thermodynamic activity of water，aw）描述有机介质中酶催化活力与水的关系。水活度（aw）定义为系统中水的逸度与纯水逸度之比，水的逸度在理想条件下用水的蒸气压代替，因此，aw可以用体系中的水的蒸气压与同样条件下纯水蒸气压之比表示。Halling提出水活度是确定酶结合水的多少的一个参数。在aw值较低的情况下，有机溶剂中键合到酶上的水量与在空气中键合到酶上的水量非常相似，表明有机溶剂没有直接影响水与酶紧密的键合。aw值较高时，极性溶剂（如乙醇）使酶结合的水量有所减少，非极性溶剂也有同样的效果。这可能是由于溶剂与键合位点的水直接竞争的结果，也证明了蛋白-溶剂界面水与溶剂存在直接作用。Halling在各种有机溶剂中得到六种悬浮蛋白水的吸附等温线，证实了上述结论。因此，建议在不同溶剂中研究酶动力学时为避免水的影响，最好保持一个恒定的水活度，以便确保有一个相似的酶水合水平。

水活度可由反应体系中水的蒸气压除以在相同条件下纯水的蒸气压而测得。在不同有机溶剂中获得恒定的水活度至少可通过三种方式：①用一个饱和盐水溶液分别预平衡底物溶液和酶制剂；②向反应体系中直接加一种水合盐；③向每一溶剂中加入固定的但不同量的水。第二个方法是由Halling提出的，他指出一个平衡的水合盐对在一定温度下能提供恒定的蒸汽压。用这个方法有效地控制了α-胰凝乳蛋白酶、脂肪酶以及枯草杆菌蛋白酶的水活度。

3.微量必需水对酶催化活性和选择性的调节控制

必需水是酶在非水介质中进行催化反应所必需的。它直接影响酶的催化活性和选择性。例如在脂肪酶催化拆分外消旋2-辛醇的反应中，当溶剂、酶等其他因素相对不变的条件下，可以用系统含水量衡量水对酶活性的影响，反应系统只有在最适含水量时，酶才有高的活力和选择性。在脂肪酶催化丁酸与丁醇的酯合成反应中当溶剂不同时，最适系统含水量随着溶剂lgP值的增加而减小［图2-4（a）］，用水活度（aw）衡量时，尽管在不同的有机溶剂中反应速率的最高值不同，但是达到最大值的最适水活度却基本相同，均在0.5～0.6之间［图2-4（b）］。因此，用水活度比用系统含水量衡量水对酶活力的影响更为合理和直观。

控制aw的方法可以用反应体系的各种组分与不同的盐饱和溶液在反应前平衡。如用下列各种盐的饱和溶液平衡，可以得到一定的aw值（20℃）。

酶的aw和整个系统的aw是一样的，系统的aw也可以用相对湿度传感器在平衡气相中测定。向干燥的反应器中直接加入某种高水合盐也可以获得恒定的水活度。Kvittingen在研究己烷中脂肪酶催化丁酸丁酯的合成反应时，以Na2SO4·10H2O/Na2SO4及Na2HPO4·12H2O/Na2HPO4·7H2O水合盐对作为水缓冲剂，控制水活度，使酶的催化效率明显提高。这种高水合盐在反应初始阶段可放结合水到体系中，供给酶必需水，本身能化为低水合盐；反应后期，低水合盐结合产物水，转化成高水合盐，反应产生的水不能在体系中积累。因此酶在整个反应中能保持高活力。曹淑桂等在脂肪酶催化拆分外消旋2-辛醇的反应体系中加入Na2P2O7（1％）的水合盐对，酶反应活性明显高于用硅胶、分子筛等其他方式控制水的体系。反应一段时间后，加盐对的反应体系中的酶粉依然保持较好的分散状态，而其他体系的酶已凝聚成块。

对于生成水的反应（如酯合成和肽合成），体系中水的积累导致酶活力降低，不利于合成反应。向该体系加入分子筛、乙基纤维素等除水剂或利用醋酸纤维素无孔聚合膜进行反应全过程蒸发，及时除去反应生成的水，能使酶保持较高的活力，有利于合成反应的进行。

Halling在物理化学所定义的标准状态下得出以下规律：①利用水活度能准确描述水解反应的平衡位置，只要水活度不变，反应平衡就基本保持不变。当aw<1时，水解反应平衡向合成方向移动，当aw足够高时，水解反应平衡向水解方向移动，若知道水解反应的平衡位置，则可以推算出aw；②有机相中酶的最适水活度（即酶活力达到最高时的水活度）与酶量无关，而对于系统含水量则随酶量的增加而增加；③在含有不同底物的各种有机溶剂中，酶的最适水活度都在0.55左右，即酶的最适水活度与溶剂的极性、底物的性质及浓度无关。Svensson也报道了脂肪酶催化酯合成的平衡常数随aw的降低而提高。因此，水活度能被用来控制平衡位点。为解决在低aw水平下反应速率较低的问题，起始反应可在高aw下进行（以获得最佳反应速率），然后到反应快结束时降低水活度，从而可获得一个高产率。

4.仿水溶剂（water-mimiking solvent）对酶催化活性和选择性的调节控制

如前所述，“必需水”是酶在有机溶剂中表现催化活性所必需的。其原因如果是由于水具有高介电常数和形成氢键的能力，那么，除水以外的具有这种性质的其他溶剂是否也能活化有机溶剂中的酶。曹淑桂等用二甲基甲酰胺（DMF）和乙二醇作为辅助溶剂，部分或全部替代有机溶剂中的辅助溶剂水。结果是DMF部分替代水后，脂肪酶催化2-辛醇酯化的活力显著降低，全部替代水后酶活力仅为水作辅助溶剂时的21％，但是比不加任何辅助溶剂时的酶活力高2倍。乙二醇替代水能显著提高酶活力。这与Zaks和Klibanov的实验结果类似，他们加入3％的甲酰胺使在辛醇（含1％水）中的多酚氧化酶的活性提高35倍。Kitaguchi详细地研究了嗜热菌蛋白酶在含有一定量的水或其他辅助溶剂的t-戊醇中催化高疏水性氨基酸的肽合成反应。结果表明，最适水量（4％）的3/4被9％的甲酰胺替代后，酶活性与最适水量（4％）时相仿；乙二醇和甘油对酶也有一定的活化效果，但比水低；DMF和乙二醇的醚类对酶几乎没有活化效果。作为辅助溶剂，它应该具有高介电常数和多点形成氢键的能力，如甲酰胺和乙二醇，它们在有机溶剂中对酶的活化机制与水相同。但是只添加甲酰胺而不添加水时，酶完全没有活性。这是因为干燥的酶水合时要经过几个阶段，其中某个阶段（可能是最初的离子化阶段）是不可能被仿水溶剂替代的。用仿水溶剂替代水的意义是可以控制和消除由水而引起的逆反应和副反应，因此，仿水溶剂的应用范围很广，而且可以开发成新的酶催化反应体系。

三、添加剂

在生物催化反应系统中，除了单纯的有机溶剂或水之外，有时还可有目的地引入一些酶反应的调节剂，以改变酶分子所处的微环境条件，进而影响酶的催化性能（包括活性、选择性和稳定性）。其实，许多商品酶制剂中含有一些分散剂或稳定剂（例如糖类），这些添加剂如果不经预处理，就会随酶一起进入反应系统，给酶促反应带来不同程度的正面或负面影响。另外，添加剂的加入也可能影响底物或产物的溶解或分散状况，降低传质阻力，提高反应速率。如果底物或产物对酶有害或存在抑制作用，则添加适当的化学试剂（如吸附剂）可消除或减轻底物或产物对酶的抑制或毒害作用。当然，引入添加剂会增加反应体系的复杂性，并可能给产品分离造成一定的困难。添加剂多种多样，操作简单，效果奇特，给微环境工程调控酶的催化性能（特别是对映选择性）提供一种可供选择的方法，因此仍然值得我们去研究和应用。添加剂的种类繁多，目前还没有统一的分类方法，主要包括无机盐类添加剂、有机助溶剂、多醇类添加剂以及表面活性剂等。

四、生物印迹

利用酶与配体的相互作用，诱导、改变酶的构象，制备具有结合该配体及其类似物能力的“新酶”，这是修饰、改造酶的一种方法。Klibonov等根据酶在有机溶剂中具有“刚性”结构的特点，巧妙地发展了这种修饰酶的技术。他们将枯草杆菌蛋白酶从含有配体N-AC-TyrNH2（竞争性抑制剂）的缓冲液中沉淀，干燥、除配体后，放在无水有机溶剂中，发现配体印迹酶的活性比无配体存在时冻干的酶高100倍；但是“印迹酶”在水溶液中的活性与未印迹酶相同。他们认为，酶在含有其配体的缓冲液中，肽链与配体之间的氢键等相互作用使酶的构象改变，这种新构象除去配体后在无水有机溶剂中仍可保持，并且酶通过氢键能特异地结合该配体。这种方法叫生物印迹（bio-imprinting）。用FTIR方法可以定量分析印迹酶的二级结构的变化，如溶菌酶、胰凝乳蛋白酶原和牛血清白蛋白用L-苹果酸印迹后，二级结构的变化主要表现为β折叠含量的降低。通常在冻干过程中，由于酶分子间形成β折叠，导致β折叠的含量升高，而印迹酶由于配体使酶分子隔开而减小了这种效果，并且在印迹过程中，配体与蛋白质形成氢键，产生了一个空穴并在去除溶剂后仍然保持。Mosbach等用该方法制备了一系列L型和D型的N-乙酰氨基酸印迹的α-胰凝乳蛋白酶，在环己烷中，“D型印迹酶”可催化合成N-乙酰-D-氨基酸乙酯，“L型印迹酶”催化合成N-乙酰-L-氨基酸乙酯的活力也比未印迹酶提高3倍左右；他们还详细地研究了“印迹酶”的活性与有机溶剂中含水量的关系，对于“D型印迹酶”水含量在1mmol/L时酶活力最高，大于此量时，随着水含量的增加，酶失去催化“D型”的活力，因为酶的构象又恢复到印迹前的构象。因此，只要控制好“印迹酶”在有机溶剂中的最适含水量，就可以用生物印迹法调节和控制酶在有机溶剂中的催化活性和选择性。

五、化学修饰

酶粉虽然在非水介质中能够催化反应，但是其催化效率比水溶液中的酶低几个数量级，其中原因之一是酶一般不溶于有机溶剂。虽然有些酶能直接溶解在少数有机溶剂中，但是酶的催化效率常常很低。双亲分子共价或非共价修饰酶分子表面，可以增加酶表面的疏水性，使酶均一地溶于有机溶剂，提高酶的催化效率和稳定性。

稻田佑二等用单甲氧基聚乙二醇（PEG）共价修饰了脂肪酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等蛋白质分子表面的自由氨基，修饰酶能够均匀地溶于苯和氯仿等有机溶剂，并表现出较高的酶活性和酶稳定性。岗火田惠雄和居城邦治等选用二烷基型脂质，以其分子膜的形式包裹酶分子表面，制成可溶于有机溶剂的酶-脂质复合体。其中酶-中性糖脂复合体在无水苯中催化三酰甘油合成的活性比PEG共价修饰的脂肪酶还高，其原因可能是因为酶-脂质复合体没有PEG长链对底物接近酶的障碍。脂质包裹酶的制备很简单，即酶的水溶液和脂质的水乳浊液在冰冷条件下混合，并搅拌过夜，离心分离、回收沉淀物、冻干，得到白色粉末。这种粉末不溶于水，溶于苯、氯仿等有机溶剂，阴离子型脂质得不到沉淀物。元素分析、IR、UV测定结果表明，粉末中每一酶分子包裹200～400个脂质，由糖脂质制备的粉末，经NMR、荧光光谱分析发现，酶分子表面与脂质的亲水基团形成氢键，这些脂质数相当于在脂肪酶分子表面包裹1～2层。岗田惠雄等用脂肪酶-脂质复合体在含有高浓度底物的有机溶剂中进行了醇的不对称酯合成反应，他们用同样的方法还制备了可溶于异辛烷的α-胰凝乳蛋白酶-脂质复合体，并研究了它们在有机溶剂中的底物选择性。用对环境敏感的水凝胶共价修饰酶，并通过调节修饰酶的环境，控制酶的溶解和沉淀行为，达到在反应过程中酶能进入溶液，并且能在均相条件下进行催化；反应结束时，酶又能从反应体系中沉淀出来，有利于酶的回收和重复使用。这是一种兼有可溶性酶均相催化和固定化酶稳定性高可反复使用的修饰酶。

六、固定化酶

酶在绝大多数的有机溶剂中是以固态形式存在的。因此，目前最简单的也是被大多数研究者所采用的非水酶催化的体系是将固态酶粉直接悬浮在有机溶剂中。但是冻干的酶粉在反应过程中常常会发生聚集，导致酶的催化效率降低。酶固定化后，增大了酶与底物接触的表面积，在一定程度上可以提高酶在有机溶剂中的扩散效果和热力学稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，有利于酶的回收和连续化生产。常用的比较简单的固定化方法有多孔玻璃和硅藻土等载体吸附法、载体表面共价交联法。

用于有机相的固定化载体和固定化方法的选择与水相有所不同，其中最重要的是，应该满足酶在有机相反应所需要的最适微环境和有利于酶的分散和稳定。Tanaka等用适当配比的具有不同亲水能力的树脂包埋脂肪酶，很好地控制了脂肪酶在有机相反应所需要的微水环境。Reslow、Mattiasson和Adlercreuts研究了固定化载体的亲水性对固定化酶在有机相中酶活性的影响。他们首次用分配到载体上的水量与溶剂中水量之比（lgAq）代表载体亲水性，研究了13种载体的lgAq值与这些载体的固定化酶在有机相中催化活力的相互关系，并指出：低lgAq值的载体有利于固定化酶在有机相中催化活力的表现，即酶活力与载体的亲水性成反比，载体的亲水性越强，与酶争夺水的能力就越强，这将不利于维持酶的微水环境，导致酶活力降低。此外，载体的亲水性强，也会增加疏水性底物向固定化酶扩散的阻力，不利于固定化酶向疏水性有机溶剂中分散，使反应速率降低。因此，选择载体时，除了考虑载体对酶“必需水”的影响，固定化酶在溶剂中的分散情况，还应该考虑底物和溶剂的疏水性。当底物和溶剂的疏水性强时，可选择疏水性固定化载体，当底物和溶剂的亲水性较强时，应该在保持较高酶活力的前提下，降低载体的疏水性以减小底物扩散的阻力。

七、反应温度

由于酶在有机溶剂中的热稳定性好于水溶液，因此，为了提高酶的催化速率可以适当提高反应温度，但是有些酶在某些有机溶剂中也会因温度高而失去活性。温度不仅影响酶的活性，而且还与酶的选择性有关。一般认为酶和其他催化剂一样，温度低，酶的立体选择性高。Philips从热力学的角度对这一观点进行了详细的论述，他认为在热力学焓的控制下，酶在较低的温度下能表现出较高的立体选择性，而在热力学熵的控制下，酶、底物和一些其他相关因素与较高的温度相匹配时，反应也可获得较高的立体选择性。

在酶催化过程中，通过温度的控制，可以有效地提高产率。曹淑桂等在脂肪酶催化油脂的甘油醇解、制备单酰甘油的反应中，采取两段温度，使单酰甘油的转化率由30％提高到60％。

八、pH和离子强度

有机溶剂中酶活性与酶干燥前所在的缓冲液的pH值和离子强度有关，其最适pH值与水相中酶的最适pH值一致。因为在有机溶剂中，酶分子表面的必需水维持着酶的活性构象，而且必需水只有在特定pH值和离子强度下，酶分子活性中心周围的基团才能处于最佳离子化状态，有利于酶活性的表现。Lohmder-Voge通过缓冲液中磷原子的核磁共振谱的变化，检测了酶由缓冲液转入微水有机溶剂后的pH值的变化。Valiverty用分子探针研究了微水环境下的pH值。他们的实验结果表明，酶由缓冲液经过丙酮沉淀或冻干后，转入微水有机溶剂中时，它能“记忆”原缓冲液中的pH值。他们称这种现象为“pH记忆”。但是Hilling和Buckleg等人在使用pH值指示剂监测冻干过程pH值的变化时，发现酵母乙醇脱氢酶在磷酸缓冲液里冻干的过程中，pH值急剧下降，同时伴有酶活力的大量丧失；还发现该酶在Tris缓冲液、Hepes缓冲液或N-甘氨酰甘氨酸缓冲液中冻干时，pH指示剂的颜色没有明显的变化，酶也比较稳定。可见各种酶在不同缓冲液中冻干时的pH值变化不同，由于缓冲液选择不当而导致的pH值急剧下降可能是酶在预处理冻干过程中大量失活的一个重要原因。为了使酶具有催化反应的最佳离子化状态，应该在酶参加反应前的预处理和反应过程中采取某些措施，如选择适当种类和适宜pH的缓冲液处理酶，使之不受冻干过程破坏。