第七节　蛋白质、酶和重组蛋白的分离纯化

蛋白质分离纯化技术无论是对酶工程还是对基因工程的发展都是至关重要的。DNA重组技术的问世，遗传工程的蓬勃发展，推动了蛋白质工程的兴起。今天，生物化学家们不仅可以利用各种先进的、灵活的蛋白质化学技术纯化、分离获得天然的蛋白质和酶，而且也可以结合分子生物学技术，改造和设计生产出那些自然界不存在、或存在量甚微、或使之具有人们所期望的新性质的酶与蛋白质。蛋白质工程产品的面市，尤其是对应用于临床医学中高纯度、高生物活性的蛋白质药物的纯化技术，变性蛋白的复性，正确折叠，二硫键配对，功能蛋白的糖基化修饰、加工及对一系列下游工艺的技术发展要求既高又迫切。

一、蛋白质纯化的一般考虑

纯化蛋白质、酶与重组蛋白所进行的战略设计最主要的考虑是应用。从量上考虑，为测定序列或克隆目的只要几微克；而为工业和医药用途考虑则可达几千克。从纯度标准的要求上看也是相差很远的，为临床治疗需要的生物药品，其纯度应达到99.9％以上。因此，考虑的战略也有着诸多不同，下列各点是应认真遵循的。

1.分离纯化用的原料来源要方便，成本要低

目的蛋白含量、活性相对要高；可溶性和稳定性要好；基因分子生物学性质的背景知识要有更多的了解，是否有cDNA序列？同源性如何？重组蛋白的表达系统、表达水平及表达方式均要确定。

2.不能破坏酶活性

生物活性分子一旦离开它赖以生存的生态环境则易破坏天然构象，易变性。因此，破碎细胞的条件要尽可能十分温和，尽早尽可能多地去除各种杂质、脂质、核酸及毒素，近年来发展起来的双液相蛋白萃取技术可同时去除这些杂质的干扰。使用极性条件要以目的蛋白的活性和功能不受损害为原则。低温和洁净的环境必不可少，要设法避免和防止过酸、过碱、重金属离子、变性剂、去污剂、高温、剧烈的机械作用和自身酶解等诸因素。器皿以聚乙烯塑料代替玻璃制品，尤其是在稀溶液的操作中更应如此。

3.分离纯化的大部分操作是在溶液中进行的

各种参数，如：pH、温度、离子强度等，以及溶液中各组分对生物活性分子的综合影响常常无法固定，以致分离、纯化操作带有很大的经验成分，因此，操作缓冲液中的物质成分要审慎地思考，避免随意性。除去对可溶性及缓冲容量的考虑之外，蛋白水解酶和核酸酶的抑制剂、抑制微生物生长的杀菌剂、稳定蛋白构象和酶活性的还原剂及金属离子等均应依不同蛋白和酶的性质、结构予以周全考虑。

4.有效的酶活力检测手段

建立灵敏、特异、精确的检测手段是评估纯化方法，判断目标蛋白产率、活性、纯度的前提。因此，建立灵敏特异性的检测方法是绝对重要的。酶活性检测可根据特异性底物的反应；其他目标蛋白的检测在未能建立特异性的免疫学检测方法之前不仅要测定它的总生物活性，还要有相应的判定指标，保证检测的特异性。重组表达的目标蛋白，在稀溶液中含量很低，因此要保证有足够灵敏的检测方法。无破坏性UV检测装置的灵敏度要高，吸收波长选取适当，如选取215nm监测。破坏性的检测手段可建立诸如荧光法或飞克（fg）水平的蛋白浓度测定方法。

5.纯化策略的选择

表1-7概述了在蛋白质、酶与重组蛋白纯化中，依其蛋白性质选用的各种纯化技术。常用的有凝胶过滤、离子交换、色谱聚焦、疏水作用、亲和分离等。

工艺次序的选择策略包括：应选择不同机制的分离单元组成一套工艺；应将含量多的杂质先分离去除；尽早采用高效分离手段；将最昂贵、最费时的分离单元放在最后阶段。也就是说，通常先运用非特异的、低分辨的操作单元，如沉淀、超滤和吸附等，这一阶段的主要目的是尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要的杂质（包括非蛋白类杂质）；随后是高分辨的操作单元，如具有高选择性的离子交换色谱和亲和色谱，而将凝胶过滤色谱这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后，这样可使分离效益提高。

色谱分离次序的选择同样重要，一个合理组合的色谱次序能够克服某些方面的缺点，同时很少改变条件即可进行各步骤间的过渡。离子交换、疏水和亲和色谱通常可起到蛋白质的浓缩效应，而凝胶过滤色谱常常使样品稀释。在离子交换色谱之后进行疏水作用色谱，不必经过缓冲液的更换，因为多数蛋白质在高离子强度下与疏水介质的结合能力较强，凝胶过滤色谱放在最后一步又可以直接过渡到适当的缓冲体系中以利于产品成形保存。但在包含体重组蛋白的纯化中，因为分离纯化的是变性蛋白，与纯化天然蛋白的性质不同，凝胶过滤色谱有时可作为首选的步骤。例如，原核基因工程重组细胞因子的分子量大多在15000～20000，而包含体中的杂蛋白分子量通常大于30000，因此选用凝胶过滤色谱能很容易获得高纯度的产品。

最后需要提出的是近年来出现的集色谱分离与膜分离于一体的径向色谱柱（radial flow chromatographic column）分离技术，它采用径向流动技术，样品和流动相是从柱的周围流向圆心，故可在较小的柱床层高度下使用较大的流动相流速，而反压降却较低，样品出峰快。由于它改变了传统的长轴流向的柱体设计和具有多层键合功能基团的交换膜，因此色谱分离的流量和负荷量大大提高，同时又由于柱体的设计可在长轴上加长、缩短和并联，因此分离规模可在基本类似的色谱条件下不断放大，适合于生物工程产品的初级分离纯化。

二、蛋白质的粗分离

1.材料的选择和细胞抽提液的制备

（1）材料的选择　分离精制蛋白质最重要的是选择适当的原料。蛋白质的来源无非是动物、植物和微生物。选择的原则是，原料所含有的目的蛋白质含量要高，而且容易获得。当然，由于研究目的不同，有时只能使用特定的原料。应当注意的是，蛋白质含量在种属间有意想不到的差别，在不同个体中也有明显的不同。由于性别、年龄、季节、饲养条件、生理或病理状态及培养条件的不同，也会有量和质的差异。从动物组织或体液中分离蛋白质时，取到材料后要迅速处理，充分脱血后立即使用或在冷库（-10～-50℃）里冻结保存备用。用植物材料分离蛋白质时要注意植物的细胞壁比较坚厚，要采取有效的方法使其充分破碎，同时，植物组织中含有大量的多酚物质，在提取过程中会被氧化成褐色产物，干扰蛋白质的进一步纯化，必须防止。另外，植物细胞的液泡内含物有可能改变抽提液的pH值，因此，对植物组织常使用较高浓度的缓冲液作为提取液。应用微生物来提取蛋白质，由于微生物可大规模培养，原料来源一般不受限制。通过基因工程技术，将某些蛋白质的基因克隆到微生物中，从而可以大量表达这些蛋白质，这对稀有珍贵蛋白质的获得有重要的实际意义。选择什么材料为好，只有从实用角度上来考虑。

（2）细胞破碎方法及细胞抽提液的制备　大多数蛋白质存在于细胞内，结合于细胞器上，所以，必须将细胞破碎，释放其中的蛋白质。要根据不同情况采用不同的破碎方法，最常用的是机械法。

为了确保可溶性细胞成分全部抽提出来，应当使用类似于生理条件下的缓冲液。常用20～50mmol/L的磷酸缓冲液（pH7.0～7.5），或0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5），或用含少量缓冲液的0.1mol/L KCl。必要时，缓冲液中可加入EDTA（1～5mmol/L）、巯基乙醇（3～20mmol/L）或蛋白质稳定剂等。动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪，切碎后放入捣碎机中。每克组织加2～3倍体积的冷的抽提缓冲液，匀浆几次，直至无组织块为止，然后离心倾出上清，即得细胞抽提液。制备植物细胞抽提液时，缓冲液中加入聚乙烯吡咯啉酮（PVP）常可减少褐变，因为它可吸附多酚化合物。

完全破碎酵母和细菌细胞，可用法兰西压榨机（French press），此仪器适用于少量细胞的破碎；破碎大量细胞可用Manto-Gaulin匀浆器。每千克细胞加2L缓冲液。这两种设备可使细胞在非常高的压力下（约800kPa）通过一小孔，利用产生的剪切力破碎细胞。另一种方法是用振动研磨机，细胞与直径0.5～1mm的玻璃球一起剧烈振荡，此法非常有效迅速。对少量微生物（几百毫升）可用超声波破碎细胞法。还应提到生物学方法。革兰氏阳性菌细胞壁易被溶菌酶消化，在37℃短时间（如15min）即可溶解细胞壁。对革兰氏阴性菌，则预先用非离子去污剂（如TritonX-100）、巯基乙醇和甘油处理细胞，可加强溶菌酶作用的有效性。如果同时加入脱氧核糖核酸酶Ⅰ（10μg/mL），可使溶液黏度降低，从而提高抽提液的质量。

（3）膜蛋白的释放　膜蛋白存在于细胞膜或有关细胞器（线粒体、叶绿体、内质网或核等）的膜上。按其所在位置大体可分为外周蛋白和固有蛋白两种类型。外周蛋白通过次级键和外膜脂质的极性头部螯合在一起，可以用含乙二胺四乙酸（EDTA）的适当缓冲液将其抽提出来。外周蛋白被抽提后，膜一般仍保持完整的双层结构。固有蛋白嵌合在双层中。抽提固有蛋白时，既要削弱它与膜脂的疏水性结合，又要使它仍保持疏水基暴露在外的天然状态，这个过程称为增溶作用。比较理想的增溶剂是去污剂，它既有亲水部分也有疏水部分，当浓度高于临界胶团浓度时形成胶团，胶团内部为疏水核，外部为亲水层。增溶时，膜蛋白疏水部分嵌入胶团的疏水核中而与膜脱离，同时又保住了膜蛋白表面的疏水结构。被增溶出来的膜蛋白通过透析等方法除掉去污剂，再进一步用其他方法分离纯化。所用去污剂按结构可分为四种：阴离子去污剂（脱氧胆酸盐）、阳离子去污剂（溴化十二烷基三甲铵）、两性离子去污剂（二甲基十二烷基甘氨酸）和非离子型去污剂（Triton X-100）。近年，非离子型去污剂辛基葡萄糖苷应用广泛，因为它的临界胶团浓度高（达25mmol/L），同时易于透析，也有利于膜蛋白的重组。释放膜蛋白的其他方法有：①用磷酸酯酶A消化膜脂肪，从而使膜蛋白释放出来；②在高pH和较高温度下进行超声作用，也能释放膜蛋白；③在低温（-20℃）下，用丙酮处理组织和细菌，可以抽提出大部分脂肪，所得无水的丙酮干粉可以储存很长时间。将丙酮干粉溶于水溶性缓冲液后，则可得可溶性蛋白质，留下不溶性的残渣。这是一种经典的现在仍在使用的方法。

（4）胞外酶的分离　胞外酶是在微生物发酵时分泌到发酵液中的。发酵后可通过离心或过滤将菌体从发酵液中分离弃去，所得发酵清液通常要适当浓缩，然后再作进一步纯化。目前常用的浓缩方法是超滤法。粗抽提液往往由于脂肪微粒、细胞器碎片或其他固体物的存在而比较浑浊，可采用高速离心法或过滤法（添加适当的助滤剂）使其澄清。粗提液中如有大量核酸，会使溶液黏度增加而影响进一步的分离纯化，可用核酸酶消化核酸，或用鱼精蛋白将核酸沉淀。

2.蛋白质的浓缩和脱盐

经硫酸铵沉淀的蛋白质在作进一步提纯以前，常要除盐，即降低离子强度。常用的除盐方法有透析法、纤维过滤透析法和分子筛色谱法，这些方法的优缺点列于表1-8中。

透析法简单，只需玻璃纸或透析袋，但每次平衡时间较长；而且要特别注意透析袋的清洁。用前要在含EDTA的溶液中煮几次，除掉污染在袋上的核酸酶和蛋白水解酶。纤维过滤透析法（fiber filter dialysis）是用泵使蛋白质溶液不断流经超滤膜制成的空心管，管的外部与透析缓冲液相连，用另一泵让缓冲液不断在管外流动。这样由于透析的有效表面积大增，使透析时间大为缩短，缺点是中空纤维超滤膜的价格昂贵。分子筛色谱法常用Sephadex G-25或Bio-gel P30柱色谱法。蛋白质在柱中不被滞留，直接流出，盐等小分子则滞留在载体中。样品量大时，可适当增加色谱柱的直径。

除盐后的样品往往体积变大，样品浓度降低。在进一步提纯时（如用凝胶过滤色谱法），要求较小体积的样品溶液。为操作方便，也要减少样品体积，因此，必须建立浓缩蛋白质溶液的方法。浓缩方法有下列几种。①沉淀法：用盐析法或有机溶剂将蛋白质沉淀，再将沉淀溶解在小体积溶液中。②吸附法：吸附到离子交换剂上，然后用少量盐溶液洗脱下来。③干胶吸附法：如向蛋白质溶液中加入固体Sephadex G-25等吸水剂，吸去水及一些小分子物质，但蛋白质的收率较低。此外，还有冻干法和真空干燥法也可用于蛋白质浓缩。这些方法不能除盐。④渗透浓缩法：将蛋白质溶液放入透析袋中，然后在密闭容器中缓慢减压，水及无机盐流向膜外，蛋白质即被浓缩。也可将聚乙二醇（PEG）涂于装有蛋白质溶液的透析袋上，置于4℃下。干PEG粉末吸收水和盐类，大分子溶液即被浓缩。PEG吸水很快。100mL蛋白液在较短时间内就能浓缩到几毫升。为防止PEG进入蛋白质溶液，最好用分子量大的PEG（如PEG20000）。⑤超滤浓缩法：这是浓缩蛋白质的重要方法。近年国内外已生产出各种不同型号的超滤膜，可以用来浓缩分子量不同（350～300000）的物质，每种膜都有一定的分子量截留值。超滤法不仅有浓缩的作用，而且有除盐、分级和纯化的作用，但分辨率远不及分子筛色谱法。此法操作方便、迅速、温和、处理样品量可大可小（从2～3mL到几百升）。超滤器有封闭式和管道式两大类。封闭式的缺点是超滤膜的孔易被大分子堵住，影响流速。管道式超滤器则可克服这个缺点，因为液体在管膜中以一定的速度流动，可避免极化（膜被堵住）现象。由于管膜的总面积很大，所以效率很高。随着样品溶液的不断循环，样品浓度逐渐增大，最终浓度可高达10％～50％，浓缩效率是封闭式超滤器的几倍。大型管式超滤器越来越多地应用于生物制品工业、食品工业以及“三废”处理等方面。

3.沉淀法分级蛋白质

水溶性蛋白质分子表面带有亲水性基团，因此很容易进行水合作用，顺利进入水溶液中。如果溶液的pH偏离于等电点，则所有分子会带相同的电荷，这进一步增进了它们的分散能力。因此，凡能破坏蛋白质分子水合作用或者减弱分子间同性相斥作用的因素，都可能降低蛋白质在水中的溶解度，使其沉淀。常用的方法有盐析法和有机溶剂法。

（1）盐析法　向蛋白质水溶液中加入中性盐，可以产生两种影响：一是盐离子与蛋白质分子中的极性和离子基团作用，降低蛋白质分子的活度系数，使其溶解度增加。在盐浓度较低时以这种情形为主，蛋白质表现为易于溶解，称为盐溶现象。二是盐离子也与水这种偶极子分子作用，使水分子的活度降低，导致蛋白质水合程度的降低，使蛋白质的溶解度减少。在盐浓度较高时这种情形起决定性作用，蛋白质便会沉淀，称为盐析现象。采用加入中性盐的方法使各种蛋白质依次分别沉淀的方法称为盐析法。

对于同一种蛋白质，盐离子的价数越高，盐析能力也越强。各种离子盐析能力的强弱可用Hofmeister序列表示：

蛋白质浓度影响盐析界限。蛋白质浓度高，盐析界限宽，即低浓度无机盐便可使蛋白质析出；反之，蛋白质浓度低，需要无机盐的浓度就高，盐析界限变窄。因此，可以通过稀释作用来调节盐析浓度的界限，从而有助于蛋白质的分离。蛋白质溶液太浓时应当稀释，否则会与其他蛋白质发生共沉淀作用。蛋白质浓度通常在2.5％～3.0％之间比较合适。

实际工作中，常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，在水中的溶解度大（25℃时为4.1mol/L），价格便宜，浓度高时也不会引起蛋白质生物活性的丧失。硫酸铵浓溶液的pH约为5.5，配制硫酸铵饱和溶液时，可在水中加过饱和量的硫酸铵，加温至50℃，至大部分盐溶解，室温放置过夜后，再用15mol/L NaOH或12mol/L硫酸调至所需pH。

盐析法的优点是操作简便，中性盐对易变性的蛋白质有一定的保护作用，使用范围广泛，同时，盐析能除去较多的杂质，有纯化作用。盐析还有浓缩蛋白质溶液的作用，有利于进一步纯化时的操作。缺点是分辨能力差，纯化倍数低。

（2）有机溶剂沉淀法　由于有机溶剂有较低的介电常数，会使溶液的介电常数减小，增强偶极离子之间的静电引力，从而使分子集聚而沉淀。另外，有机溶剂本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水合层，也促使蛋白质分子脱水而沉淀。

选用有机溶剂的原则是：①必须能与水完全混溶；②不与蛋白质发生反应；③要有较好的沉淀效应；④溶剂蒸气无毒。丙酮和乙醇符合上述要求，因此是使用最为广泛的两种有机溶剂。

在低介电常数的环境中，蛋白质分子上基团间的作用力会受到影响，超过限度时会使蛋白质变性。因此，有机溶剂沉淀法一般都要在低温（0℃±1℃）下进行。中性盐的加入能增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，并能防止蛋白质变性。但含盐过多会使蛋白质过度析出，不利于分级沉淀。一般采用0.05mol/L以下的稀盐溶液。蛋白质本身是多价离子，对溶液的介电常数有相当大的贡献。当蛋白质浓度太低时，如添加有机溶剂过度会产生变性现象，若这时加入介电常数大的物质（如甘氨酸），可避免蛋白质变性。蛋白质浓度高时，溶液的介电常数也相应提高，可以减少蛋白质变性。但若蛋白质浓度过高会引起共沉淀现象而影响分离效果，所以必须选择恰当的蛋白质浓度才能得到好的分级效果。用有机溶剂沉淀蛋白质时，如果溶液的pH处在等电点条件下，蛋白质的溶解度最低。因此，按各种蛋白质的等电点来调节pH值，有利于它们的分离。有机溶剂沉淀法比盐析法的分辨率高，使用恰当时提纯效果好。此法已广泛用于生产蛋白质制剂。

（3）有机聚合物沉淀法　除了盐和有机溶剂能使蛋白质沉淀外，水溶性中性高聚物也能沉淀蛋白质。分子量高于4000的PEG可以非常有效地沉淀蛋白质。最常使用的是分子量6000和20000的PEG。PEG可看作是聚合的有机溶剂，其作用原理可能与有机溶剂类似。PEG难于从蛋白质分级物中除去。因为是聚合物，使用透析法和分子筛法除PEG都不理想，特别是对分子量20000的PEG更是如此。但残余的少量PEG对蛋白质无害。盐析、离子交换、亲和色谱、凝胶过滤常可在不除去PEG的情况下进行。其他带电聚合物（多价电解质）也可用于蛋白质纯化，而且特别适用于工业规模应用。

（4）选择性变性沉淀法　有些蛋白质相当稳定，可忍受极端环境条件。因此，如果所要的蛋白质很稳定，那就可将不纯混合物暴露于极端条件，使不想要的蛋白质变性，并从溶液中沉淀出来，从而使所要的蛋白质得到进一步纯化。选择性变性有三种：热变性，pH变性和有机溶剂变性。这三种方法，一般来说，不是独立的，因为温度变性对pH的依赖性很强，反之亦然，而有机溶剂变性蛋白质时，则要小心控制温度、pH和离子强度。等电点沉淀法是pH变性法的一种变体。若已知待沉淀蛋白质的等电点，则可通过调节pH，将其沉淀下来。

三、蛋白质的大规模分离纯化

经过粗分级后的蛋白质，为了获得更高的纯度，还要进行细分级，这主要是通过各种色谱方法来实现的。关于蛋白质的色谱分离技术在一般的生化实验书中都有较详细的介绍，兹不赘述。这里主要讲与酶工程关系密切的蛋白质的大规模分离纯化的有关问题。近年来，对大规模纯化蛋白质的需求日益增加，这是因为作为临床治疗药物和工业上的应用日益广泛，尤其是生物技术的发展，如发酵工程、酶工程与基因工程技术的发展和生物技术产品的开发，使蛋白质制品的大规模分离纯化已成为当前生物技术工程中的关键技术问题。

“大规模”指的是作为商业出售的蛋白质制品，至少要有数十克或数百克，乃至达千克以上。这里讨论的方法适于使用10～50kg的起始材料，因为这个规模正好反映出实验室规模和工业规模的主要差别。事实上，这个规模足以满足对很多蛋白质制品的需求。

作为商业目的，以工业规模分离蛋白质和酶制品，需要设备、材料、人力上的大量投资，因此主要的考虑是生产价格。这与最终产品的价值有关，所以纯化产品的收率特别重要。有些在实验室规模上能用的技术可能不适于大规模使用，特别是抽提方法更是如此。虽然大多数工业纯化方法所依据的原理与实验室采用的方法相同，但实际应用时要考虑的因素则稍有不同。下面我们从放大和工业生产酶的角度来讨论抽提、纯化蛋白质和酶制品的各种方法。

1.酶蛋白的来源及释放

这个问题我们在前面已经提及，对于大规模纯化来说，还是以微生物作为来源为好，这是因为微生物含有很多哺乳动物中没有的有用蛋白质和酶制品，而且可以采用微生物遗传较容易地筛选出新的高活力蛋白质和酶制品；细菌可以任何规模生产，这就保证了供应的连续性；利用遗传工程的方法足可在细菌中高水平表达所需要的蛋白质和酶，随着酶技术的不断进步，从原始动植物组织中提取酶的方法逐渐淘汰，因此，酶大规模生产基本上都是处理微生物样品。胞外酶可以很容易地从发酵液中分离出来，并能用最少的步骤纯化成便于使用的状态。它们通常是非常稳定的接近球状的水溶性蛋白质。然而，很多有用的酶是在胞内的，要用较复杂的技术才能纯化它们。

随着表达水平的提高，遗传工程将对酶纯化产生深刻的影响。然而，当某种蛋白质在细胞内的浓度过高时，会形成缠在一起的不溶物，难于分离。尽管遗传工程的发展令人鼓舞，但仍不能忽视发酵条件的重要性，因为发酵条件与蛋白质纯化有关。培养基的性质和所用抗泡沫剂会影响蛋白质的抽提，而收获细胞的时间长短常取决于细胞壁的强度和蛋白水解酶的含量。

从哺乳动物细胞中释放蛋白质较简单，标准的实验室组织捣碎法很易放大。大规模释放细菌蛋白质则困难得多。最常用的是剪切法。既可用Manton-Gaulin匀浆器，也可使用Dyno-Mill球磨机。前者类似于压榨机，后者是连续流动装置。二者每小时均可破碎100kg细菌细胞糊。球磨机的显著优点是，可在封闭体系中安全破碎致病菌或遗传工程菌。调查表明，使用Manton-Gaulin匀浆器大规模破碎细胞是最普及的。

2.分离和浓缩

细胞破碎后，纯化胞内酶的第一步是除掉细胞碎片。固-液分离是酶分离的中心环节，可用离心、过滤、双水相体系萃取、超滤和沉淀法分离、浓缩目标蛋白。

（1）离心　大规模纯化需要工业用连续流离心机。这类离心机分离固液的能力不如实验室用离心机，因为它所达到的g值较低，物质在离心机中停留的时间较短，但连续流离心机可以不间断地持续处理样品，所以适合用于大规模生产。转筒形离心机（tubular-bowl centrifuge）所能达到的最高g值为16000，设计的沉降途程短，可容纳60kg固体。也可采用间歇卸料的圆盘式离心机（disc centrifuge）。

（2）过滤　过滤是从细胞抽提物中除掉固体的另一种方式。然而，微生物抽提液常有凝胶化的趋向，难于用传统方法有效过滤，常发生严重的堵塞，除非加大过滤面积，但这是一个花钱多的解决办法。目前涡流膜过滤法（cross-flow membrane filtration）可以代替离心法。用此法所得的滤液的比活比用离心法得到的上清液的比活要高，而且所需时间短，投资也显著降低。此法中，抽提液以直角流向过滤方向，使用足够高的流速，可以通过自我冲洗作用而防止堵塞，但自我冲洗作用产生的剪切力有可能引起酶活力丧失。已用此法成功地将细胞碎片与羧肽酶、芳基酰胺酶分离。关于膜的性能的研究还在继续之中。各向同性膜易产生极化现象；具有不对称结构的膜则不易堵塞，而且可处理浓度较高的物质。

（3）双水相体系萃取法　该技术是近年涌现出来的具有工业开发潜力的各种新型分离技术之一，特别适用于直接从含有菌体等杂质的酶液中提取纯化目的酶。此法不仅可以克服离心和过滤中的限制因素，而且可使酶与多糖、核酸等可溶性杂质分离，具有一定的提纯效果，有相当大的实用价值。

①双水相的形成　将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物的浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相溶的两相，构成双水相体系。双水相体系的形成主要是由于聚合物的空间位阻作用，相互间无法渗透，而具有强烈的相分离倾向，在一定条件下即可分为两相。

②萃取原理　一般认为，双水相体系萃取技术能分离物质的原理在于利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。当生物分子进入双水相体系后，由于其表面性质、电荷作用以及各种力（疏水键、氢键、离子键等）的存在，使其在上相和下相之间进行选择性分配，表现出具有一定的分配系数。在很大的浓度范围内，要分离物质的分配系数与浓度无关，而与被分离物质本身的性质及特定的双水相体系的性质相关。

③影响分配的主要因素　生物分子在双水相体系中的分配系数并不是一个确定的量，它要受许多因素的影响，如双水相体系的性质（构成双水相体系的物质的种类、结构、平均分子量、浓度）、要分离物质的性质（电荷、大小、形状）、离子的性质（种类、浓度、电荷）和环境因素（温度、pH）等，不同物质在特定体系中有不同的分配系数。对于某个生物分子，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，通过对上述因素的系统研究，确定最佳操作条件，即可得到合适的分配系数，达到分离纯化的目的。

（4）浓缩技术　发酵液或粗提液的体积往往很大，而有效蛋白质的浓度又十分低，为了更好地与后续工艺衔接，浓缩是十分必要的。常用的适于大规模操作的浓缩技术有两种：沉淀法和超滤法，这两种方法都有一定的提纯效果。

①沉淀法　沉淀技术，特别是使用硫酸铵的盐析法是实验室中广泛采用的方法，但容易使离心机腐蚀。对大规模操作来说，沉淀法不那么吸引人，因为固-液难于分离；特别是用硫酸铵沉淀时更是如此，而且分辨率低。但优点是所需费用较低。在低pH下的等电点沉淀在某些例子中是澄清细菌抽提液的有用方法，因为可除去很多细胞壁物质，但使用并不普遍。用有机溶剂沉淀蛋白质，由于温度控制及有机溶剂易燃等问题，很少用于大规模操作。但用乙醇可分级人血浆，乙醇在医药上是可接受的这个优点抵消了它的缺点。

用非离子聚合物可以工厂规模选择性沉淀蛋白质。聚合物的作用类似于有机溶剂，其特点是无毒、不易燃，而且对大多数蛋白质有保护作用，所以特别有用。另一个用于蛋白质沉淀的聚合物是聚丙烯酸，已用它成功地以工业规模从Aspergillus spp.中纯化淀粉葡萄糖苷酶，从大豆中生产淀粉酶。聚丙烯酸的主要优点是浓度较低时就能起沉淀作用。

②超滤法　超滤已是浓缩蛋白质溶液的标准实验室方法。常用具有单一膜的搅拌式超滤器。对于大规模浓缩有两种方法，一是使用湍流式超滤器，膜装在狭窄盘绕式通道内，用泵使蛋白质溶液在通道内高速循环，以使膜上的浓度极化作用降至最低。这类装置的膜面积可达0.07m2，超滤速度可达10L/h。二是使用中空纤维膜超滤器。膜是涂在直径0.5～1.0mm的中空纤维内壁上的，许多根细纤维（多达千根）捆成一束，用泵使蛋白质溶液在中空纤维腔内高速循环，以降低浓度极化作用。工业规模使用的中空纤维超滤装置的膜面积可达6.4m2，超滤流速最高可达200L/h。

3.大规模色谱技术

实验室常用的普通色谱技术都可以大得多的规模用于纯化数十克乃至千克级的蛋白质制品。表1-9列举了这些色谱法，但使用的顺序要仔细考虑。第一步必须能处理大体积溶液，并能减少样品的总体积。

（1）离子交换色谱　离子交换色谱是大规模纯化中最有用的一步，因为它的分辨率高，纯化规模也易于扩大。当样品体积很大时，分批吸附和洗脱常能获得成功。例如，从胡萝卜软腐欧文菌（Erwinia carotovora）中纯化天冬酰胺酶，若用CM-纤维素分批吸附并洗脱，可使样品纯化6倍，体积减小为1/100。梯度洗脱也可用于大规模离子交换色谱，例如，从20kg嗜热脂肪芽孢杆菌中纯化甘油激酶，使用柱体积为40L（80cm×25cm）的DEAE-Sephadex，用200L磷酸盐浓度线性增加的梯度进行洗脱。Atkinson等人用体积86L的DEAE-Sephadex柱（80cm×37cm）从嗜热脂肪芽孢杆菌中同时纯化出5种酶。

纤维素和Sephadex离子交换色谱的缺点是床体积易被压缩，同时，随着pH的变化，床体积也变。为避免这些缺点，近年将离子交换基团引入到交联琼脂糖（如Sepharose Fast Flow）或大孔合成凝胶（如Trisacryl、Fractogel）上。这类离子交换材料既坚硬，吸附容量又大；其颗粒为小球形，既能保持高流速，又具有高分辨力，适于大规模色谱。由于材料坚硬，所以色谱结束后，可用NaOH在柱中使色谱材料再生。最近有人将纤维素与聚苯乙烯结合成procell，所得到的DEAE-procell和CM-procell也可保持高流速，已用于从牛血浆中大规模提纯免疫球蛋白和白蛋白。用5L柱，线性流速可达900cm/h，可提纯数克的蛋白质。

（2）凝胶过滤　传统的凝胶过滤介质（Sephadex、Bio-gel）由于机械强度差，不适于大规模操作。介质颗粒坚硬、耐压对大规模操作来说特别重要，因为它决定能否获得高流速。近年开发了各种类型的坚硬凝胶，如Sephacryl、Ultrogel AcA、Trisacryl、Fractogel、Superose、Cellulofine等。

（3）疏水色谱　接有辛基和苯基的琼脂糖是最常用的疏水吸附剂，这些材料吸附蛋白质的容量很大。现在疏水色谱的应用日益广泛，特别是在大规模纯化上更是如此。与离子交换色谱比，虽然疏水色谱的选择性较低，但不同类型的疏水吸附剂之间却存在着选择性。对某种待提纯的蛋白质，可选用不同的疏水吸附剂进行试验，看纯化效果。这类差别色谱（differential chromatography）显然有巨大的潜力。对于在疏水柱上吸得很牢的脂质和其他疏水配体，可用亲和洗脱法成功地将它们从柱上洗下。最近有人用超氧化物歧化酶为模型蛋白，将疏水色谱扩大成工厂规模。100L发酵罐生产的物料，可用15L疏水柱一次纯化。经用SDS-PAGE等鉴定产品纯度表明，所有数据都与实验室规模相同，分辨率也可与小规模使用时相比拟，而且在负载过量的情况下也不影响分辨率。疏水色谱柱还有清除DNA和热原的作用，适用于生产人用药物。

（4）亲和色谱　亲和色谱是从复杂混合物中纯化蛋白质的最好方法；虽然此法在实验室中已广泛采用，但以工业规模纯化蛋白质还未普及。这里的关键是亲和配体的选择。使用固定化核苷酸的亲和色谱很少用于工业规模，这是因为它不稳定，价格贵，吸附容量低，难于连到支持物上。然而，用固定化染料为配体的亲和色谱已用于很多酶的大规模纯化上，这是因为染料便宜、稳定、吸附容量高，又易于连到载体上。

（5）高效液相色谱（HPLC）　所有普通的色谱技术都可以HPLC的形式加以利用。但用HPLC纯化蛋白质的报告大多局限于实验室规模（数毫克到数十毫克）。然而HPLC用于大规模纯化蛋白质是有潜力的。已经开发出以克量级纯化蛋白质的HPLC技术。目前发表的唯一例子是用三嗪染料亲和纯化乳酸脱氢酶。每次色谱可处理1.8g蛋白质，得到97mg均一的酶，收率为46％，耗时1h。由于HPLC的柱体积可以加大，加上仪器操作自动化，可以在同一柱上反复负载样品，所以，用HPLC大规模制备的潜力是很大的。多家公司的HPLC已备有大规模制备的色谱柱。

高效液相亲和色谱（HPLAC）将亲和色谱的高分辨力和HPLC的快速结合起来，因此，无论是在分析上还是在制备上都可作为生物工程的新工具。例如，最近开发出制备规模用的亚微米无孔硅胶纤维。此纤维的渗透性好，可保持高流速。在此纤维上涂一层连有NAD配体的葡聚糖，这种亲和材料的色谱性质非常好，可能是由于无孔而能与动相迅速达到平衡。用100g NAD-纤维材料装的短柱在30min内，可从部分纯化的牛心抽提液中吸附1.5g乳酸脱氢酶，然后用盐洗脱30min，即可得到纯度大于99％的酶产品。柱再生后，又可进行下一次循环。这个结果表明，用HPLAC大规模纯化酶已处于商业突破的边缘，特别是在用传统色谱技术（如离子交换色谱）不能得到满意结果时，更显出它的优越性。