第四节　影响酶活性的因素

一、酶活测定方式

酶的存在量可以根据它催化所产生的效应即把底物转化为产物来进行测定。为了测定酶活力，必须了解酶催化反应总的反应式，而且分析程序必须能够测定底物的消失或产物的生成。此外，还必须考虑酶是否需要某种辅助因子（cofactors）、酶的最适pH和最适温度。对哺乳动物来源的酶，最适温度通常在25～37℃。最后，测定的反应速率是酶的活性，它必须不受底物供应不充分的限制。因此，一般要求非常高的底物浓度以使实验测定的起始反应速率与酶浓度成正比。

酶活力最方便的测定是测量产物出现的速率或底物的消失速率。如果底物（或产物）在特殊波长下吸收光，根据它们在此波长下吸收光的变化即可测得这些分子的浓度变化。这可用分光光度计（spectrophotometer）来完成。因为光吸收与浓度成正比，吸收光改变的速率与酶活力，即每单位时间底物用去的物质的量（或产物形成的物质的量）成正比。

在酶活测定中利用吸收光测量的两个最常用的分子是还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）。它们在紫外线（UV）区的吸收波长为340nm，因此，如果NADH或NADPH在反应过程中产生，那么在340nm处的光吸收将相应地增加。当反应是NADH或NADPH分别氧化为NAD+或NADP+时，吸收将会相应地降低，因为它们的氧化型在波长340nm处不吸收光。

二、酶联测定法

许多反应的底物和产物在可见光波长不产生光吸收。在这种情况下测定催化此反应的酶，可将其与第二个具有特殊吸收光变化的酶反应相连接（linking）（或偶联，coupling）。例如，利用葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）的作用，可用于测量糖尿病患者血液中葡萄糖的浓度，由底物转化为产物没有吸收光的变化。但是，在此反应中产生的过氧化氢能被过氧化物酶作用，并把一个无色化合物转化为有色化合物——色素原（chromogen），它的光吸收很容易被测量。如要对第一个酶（葡萄糖氧化酶）的活性作精确的测量，第二个酶（过氧化物酶）和它的共底物或辅酶必须过量，使酶联测定不属于限速步骤。这可保证色素原的产生速率与H2O2的产生速率成正比，它的产生又与葡萄糖氧化酶的活性成正比。

三、酶反应速率

酶催化反应的速率通常称作它的速率（velocity）。酶反应速率通常记录为时间为0时的值（符号V0，μmol/min），因为产物尚未出现，在这点上速率是最快的。这是因为在任何底物转化为产物之前底物浓度是最大的。还因为酶可能受到它本身产物的反馈抑制（feedback inhibition），而且反应产物将刺激逆反应。酶促反应形成的产物对时间的典型的图表明，产物迅速形成的起始期，构成图形的线性部分（图1-7），随后，酶速率缓慢下降，因为底物被消耗或酶逐渐失去活性；V0的获得是以零时点（time-point）为起点作一与曲线的线性部分相切的直线，这一直线的斜率即等于V0。

图1-7　酶促反应产物形成和时间之间的关系

酶活力单位（enzyme units）可以用许多方式表示。最普通的是被催化的反应的起始速率（V0）（如每分钟底物转换的物质的量；μmol/min）。也有两种酶活力的标准单位，即酶单位和“开特”（kat）。酶的1个活力单位是在该酶的最适条件下，在25℃、1min内催化1μmol的底物转化为产物的酶量。“开特”是酶活力的国际单位（SI），它规定：在特定体系下，反应速率为每秒转化1mol底物所需的酶量。在两种不同的酶活力单位之间可用1μmol/min=1U=16.67nanokat换算。活力这名称（或总活力）涉及在样品中酶的总单位，而比活力是每毫克蛋白质酶单位的数目（U/mg）。比活力是酶纯度的量度，在酶的纯化过程中它的比活力增高，当酶提纯时，其比活力值成为极大和恒定。

四、底物浓度

酶速率对底物浓度（［S］）的依赖关系的正常模式是在低的底物浓度下，［S］增加1倍，将导致起始速率（V0）也增加1倍。然而，在较高的底物浓度下，酶被饱和（saturated），进一步增高［S］，只导致V0的微小变化。这是因为在有效的饱和底物浓度下，所有的酶分子已有效地与底物结合，这时，总的酶速率依赖于产物自酶解离下的速率，若进一步加入底物也将不发生影响。V0对［S］的关系图形称为双曲线（hyperbolic curve）（图1-8）。

图1-8　底物浓度［S］和起始反应速率V0之间的关系

五、酶浓度

在底物浓度为饱和的情况下（即所有的酶分子都与底物结合），酶浓度的加倍将导致V0的加倍。V0与酶浓度的关系图为直线图形。

六、温度

温度从两方面影响酶促反应的速率。首先，升高温度增加底物分子的热能（thermal energy），增高反应的速率。然而较高的温度会带来第二种效应，增加构成酶本身蛋白质结构的分子热能，也就增加了多重弱的非共价键相互作用（氢键、范德华引力等）破裂的机会。这些相互作用维系着整个酶的三维结构，最终将导致酶的变性（解折叠，unfolding）。酶的三维构象甚至微小的变化都会改变活性部位的结构，导致催化活性的降低。升高温度以提高反应速率的总效应是这两个相反效应之间的平衡。因此，温度对V0关系的图形将为一条曲线，它可清楚地表示出酶的最适温度范围（图1-9）。多数哺乳动物来源的酶，其最适温度为37℃左右，但也有些生物机体的酶适应在相当高或相当低的温度下工作。例如，用于聚合酶链式反应的Taq聚合酶（Taq polymerase）是在温泉中的高温细菌中发现的，因此适于在高温下工作。

图1-9　酶活性

七、pH

每个酶都有最适pH，在此pH下催化反应的速率是它的最高值。最适pH值的微小偏离，会使酶活性部位的基团离子化发生变化而降低酶的活性。pH发生较大偏离时，维护酶三维结构的许多非共价键受到干扰，会导致酶蛋白自身的变性。V0对pH的关系图形通常将得到钟形曲线（图1-9）。许多酶的最适pH在6.8左右，但是各种酶的最适pH是多种多样的，甚至同一种酶针对不同底物的最适pH也不同，因为它们要适应不同环境进行工作。例如，消化酶胃蛋白酶（pepsin）要适应在胃的酸性pH下工作（大约pH2.0）。