3.3　酶的催化机制

3.3.1　底物与酶的作用方式

锁匙学说（lock and key theory）是早期为解释酶的立体专一性而提出的假说[图3.13（a）]。把酶的结构看作刚性的模板，比作“锁”，底物分子像“钥匙”一样，只有能与锁内部结构相吻合的钥匙，即底物与酶形成紧密的互补结构，才能打开这把锁。但该理论无法解释酶催化可逆反应的能力，固定不变的酶结构与实际情况不符。

诱导楔合学说（induced-fit theory）是在酶-底物作用模型基础上进行的修正，认为酶结构有一定柔性且构象可变。酶与底物相遇时被诱导发生构象变化，使活性中心基团正确排列或定向，与底物形成中间过渡产物。这种诱导作用包括底物对酶和酶对底物的双向诱导[图3.13（b）]。

诱导楔合学说中提出的酶-底物中间过渡产物假设已得到实验验证，电子显微镜下可以观察到核酸及其聚合酶的复合物。有酶参与的过渡态活化能比无酶参与的反应活化能要低许多，如蔗糖酸水解的活化能为108.1kJ/mol，酵母蔗糖酶的存在使活化能降为46.0kJ/mol；盐酸催化酪蛋白水解的活化能为86.2kJ/mol，胰蛋白酶催化的活化能为50.2kJ/mol。

酶与底物分子的相互作用形式有邻近与定向效应和底物形变与诱导楔合。

1）邻近与定向效应

由于酶催化部位的特殊结构，促使底物与酶的催化基团在一定空间内相互接近，底物分子被定向定位，处于恰当位置上与酶结合，使底物有效浓度得以提高，酶发挥出极高的催化效率，这种效应称为邻近效应（proximity effect）和定向效应（orientation effect）。例如图3.14中的2个有机化学反应，（a）反应是咪唑催化对硝基苯乙酸水解，（b）反应是将咪唑连接到对硝基苯乙酸分子上进行的水解反应。在同一分子内，咪唑对邻近羰基的亲核进攻机会增加，使（b）反应速率比（a）反应增加24倍。

2）底物形变与诱导楔合

1958年Daniel Koshland提出的诱导楔合学说（induced fit），即酶与底物相互作用形成过渡态（transition state），使底物分子扭曲变形，酶自身也发生构象变化。酶的构象变化有利于与底物形成过渡态，大大增加酶促反应速率。溶菌酶与底物结合时，通过X射线晶体结构分析得知，D-糖环由椅式变成半椅式构型，其构象更接近于过渡态形式。

3.3.2　酶催化作用机制

酶促反应可以用下面简单的形式表示：

式中，E、S和P分别代表酶（enzyme）、底物（substrate）和产物（product）；ES和EP分别代表酶-底物和酶-产物的中间过渡态。

酶催化反应是通过酶与底物的作用，形成了有利于反应进行的中间过渡态，降低了反应所需要的活化能。一般认为，酶与底物之间通过非共价键相互作用，作用力包括静电引力、氢键、疏水相互作用、范德华力等；另有假设认为某些酶催化的反应是通过酶与底物形成共价键而进行的。酶活性中心的微环境在催化过程中将发生不同的变化或作用。酶的催化机理主要有以下几种。

1）酸碱催化

酸碱催化（acid-base catalysis）分狭义酸碱催化和广义酸碱催化。狭义酸碱催化是指在水溶液中通过H+或OH-进行的催化，其催化速率只依赖于溶液的pH，不受缓冲液浓度的影响。但是在生理条件下，其他分子也参与质子的转移，如多种弱的有机酸可以替代水作为质子供体，弱的有机碱可以作为质子的受体。催化速率不仅依赖pH，还与缓冲液浓度成正比。广义酸碱催化是指通过Brönsted酸提供质子，或者是Brönsted碱接受质子，降低反应活化能的过程，氢质子的转移使反应速度大大加快。

许多酶的活性中心含有一些参与酸碱催化的功能基团（表3.4），如组氨酸的咪唑基既可以作为质子供体，又可以作为质子受体，是一个最有效、最活泼的催化功能基团。此外Asp、Glu、Lys、Arg、Cys、Tyr和Ser等氨基酸残基的侧链都可以起到酸碱催化作用。pH值的变化影响活性中心功能基团的解离状态，因此酶的催化作用受到pH的影响。

溶菌酶、牛胰核糖核酸酶A（RNase A）和牛胰凝乳蛋白酶等都是参与酸碱催化的酶。

2）共价催化

共价催化（covalent catalysis）是底物与酶通过共价键，形成不稳定的中间复合物，使反应活化能降低，提高反应速率的过程。在共价催化中，酶与底物通过亲核反应形成不稳定的共价键，再通过酶亲电催化将电子从反应中心除去，最后解除共价键，得到产物和酶，因此共价催化的酶必须具有较高的亲核性能和较好的基团解离能力。酶分子中Lys的ε-氨基、His的咪唑基、Cys的巯基、Asp的羧基和Ser的羟基等可以参与共价催化反应，此外焦磷酸硫胺素、磷酸吡哆醛等辅酶也参与共价催化作用。

细菌的蔗糖磷酸化酶在催化蔗糖磷酸化时，酶与蔗糖中的葡萄糖分子通过糖苷键形成葡萄糖-酶中间产物，再与磷酸形成葡萄糖磷酸。

3）金属离子催化

在已知的酶中，大约有三分之一的酶需要有金属离子存在才具有催化活性。在金属酶催化反应中，金属离子的作用表现在如下几个方面。

①金属离子与底物定向结合，指导底物反应。这种作用类似于酸催化，金属离子中和负电荷，作用比质子要强。在pH中性时，H+浓度不如金属离子的浓度高，而且许多金属离子电荷都大于+1。

②通过离子价态的可逆变化传递电子，如线粒体呼吸链中的一些酶都含有铁或铜离子，这些金属离子以辅基形式传递电子，调节氧化还原反应。

③稳定带电荷的反应过渡态或屏蔽负电荷，如激酶的底物是Mg2+-ATP复合物（图3.15），Mg2+的作用除定向效应外，还有静电屏蔽磷酸基团所带负电荷的作用，去除这些负电荷对亲核试剂（尤其是负离子）的亲核进攻产生的排斥作用。

④提高水的亲核性能。金属离子与周围水分子的OH-结合使水更具酸性，显示亲核催化能力。碳酸酐酶是一种含有Zn2+的金属酶，催化CO2生成碳酸根，其中Zn2+与水分子和3个His残基侧链配位形成四面体结构，水分子被极化，提高了对CO2的亲核攻击能力，生成（图3.16）。

3.3.3　酶催化反应机制举例

1）溶菌酶

1922年英国细菌学家Fleming在鼻黏液中发现了溶菌酶（lysozyme），后来发现眼泪中富含溶菌酶，但它对强致病性的细菌作用不大，7年后他又发现了高效的抗生素——青霉素。

溶菌酶主要存在于鸡蛋清和动物泪液中，可催化水解一些细菌细胞壁多糖，使细胞壁溶解。溶菌酶的种类较多，不同来源的溶菌酶组成和性质有所差异。如人溶菌酶的分子量为14600，由130个氨基酸残基组成；鸡蛋清溶菌酶由129个氨基酸残基组成，分子量在14000～18000，是碱性球状蛋白。按照底物不同溶菌酶可分为：内-N-乙酰己糖胺酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶和甘露聚糖酶、酰胺酶、磷酸甘露糖酶、几丁质酶、脱乙酰壳多糖酶等。

内-N-乙酰己糖胺酶能够催化水解细胞壁肽聚糖分子中的N-乙酰胞壁酸（NAM）与N-乙酰葡萄糖胺（NAG）之间的β-1，4-糖苷键，使肽聚糖分子发生断裂。反应第一步是将Glu35上的氢质子加到糖苷键的氧原子上，使糖苷键断开，产生正碳离子；之后Asp52得到水离解的氢质子，羟基加到正碳离子上，完成水解反应（如图3.17）。

溶菌酶催化反应时，其活性部位通常被6个糖基填满，其催化机制主要有：①酸碱催化，Glu35以酸的形式提供质子给糖苷键的氧原子，促使糖苷键氧原子间的键断裂；②邻近与定向效应，Asp52的负电荷羧基通过静电作用形成并稳定了糖环中的正碳离子，酶使底物接近形成过渡态的构象。

2）丝氨酸蛋白酶

丝氨酸蛋白酶（serine proteases）是一类蛋白水解酶，因酶的活性中心都含有Ser残基并具有相似的催化作用而得名。这类酶包括胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）、弹性蛋白酶（elastase）、凝血酶（thrombin）、枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）、纤溶酶（plasmin）等。其中胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶为消化酶，在胰腺中合成，以非活性的酶原形式分泌到消化道中，酶原在消化道中被去除部分肽段，转变成活性酶形式。这三种酶的一级结构具有同源性，空间结构也相似，具有相似的催化水解肽键作用，但对肽键的选择性不同。胰蛋白酶水解碱性氨基酸Arg和Lys羧基参与形成的肽键，胰凝乳蛋白酶选择性水解芳香族氨基酸羧基参与形成的肽键，弹性蛋白酶主要水解中性氨基酸羧基参与形成的肽键，专一性较前两种酶差。

从X射线衍射结果得知，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶的催化机制相似，但对肽键的选择性有所不同（图3.18）。胰蛋白酶结合部位含有带负电荷的Asp残基，能与带正电荷的Lys和Arg更好地结合。胰凝乳蛋白酶的结合部位是一个疏水性大口袋，允许侧链较大的芳香族氨基酸和侧链较大的非极性氨基酸进入。弹性蛋白酶的口袋较浅，且结合部位入口有两个侧链分支的Val和Thr存在，所以只能允许小氨基酸如Ala、Gly等进入酶活性区域。

胰凝乳蛋白酶含有245个氨基酸残基，活性中心由His57、Ser195和Asp102三个氨基酸残基组成，其中Ser195是通过二异丙基氟磷酸（DIFP）化学修饰确定为活性中心的重要基团，而His57则通过不可逆抑制剂N-对甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）确定为活性中心的功能基团。通过X射线晶体结构得知His57与Ser195在空间相邻排列，Asp102的侧链羧基也在附近，通过一个氢键定位His57，由此构成了活性中心的“催化三联体”（图3.19）。

胰凝乳蛋白酶催化肽键水解是典型的酸碱催化和共价催化的例子，通过酰化和去酰化两步完成催化反应。首先由His57作为广义碱获取Ser195的氢质子，促使Ser195的羟基高度极化，对底物肽键的酰基具有很强的亲核进攻能力，使带负电荷的Ser195羟基氧与底物酰基和氨基形成共价中间体；其次由His57提供质子给肽键的酰胺氮，形成另一个不稳定的酰基-酶中间体，促使C—N键断裂，脱酰化后产物胺与酶分离，水分子进入产物胺的位置；最后由His57作为广义酸提供质子给Ser195羟基氧，使酰基-酶中间体解离，断裂的肽链羧基脱去质子并从活性中心脱离，完成整个催化过程。