1.3　脱氮微生物的研究现状

1.3.1　土壤氮素转化的关键微生物

土壤中微生物种类繁多，参与土壤中的一系列迁移转化，土壤微生物是氮素等营养元素循环转化的引擎，很多研究都表明土壤微生物群落结构控制着各生态系统中的氮素转化。氮循环分为四个主要过程：生物固氮、氨化、硝化和反硝化，这四个过程都是由微生物驱动的。其中，硝化作用是氮循环的中心环节，它连接着生物固氮与反硝化作用，决定植物对氮素的有效利用程度，且与过量氮肥投入导致的水体污染和温室气体释放等一系列生态环境问题直接相关。硝化作用包括两个步骤，第一步是将氨转化为亚硝酸盐，第二步是将亚硝酸盐转化为硝酸盐，分别由亚硝化细菌和硝化细菌来完成。氨氧化细菌（即亚硝化细菌）在硝化作用过程中负责将氨氧化为亚硝酸盐，实现亚硝化作用，这是硝化过程中必不可少的步骤，也是硝化过程中的限速反应。近来的研究还发现了厌氧氨氧化作用，即厌氧氨氧化菌可以在缺氧环境中，将用氧化为氮气。反硝化是指硝酸盐氮和亚硝酸盐氮在反硝化细菌的作用下，被还原成氮气的过程，近年来，异养硝化细菌和好氧反硝化细菌等的发现，丰富了人们传统的理论观点，改变了以往觉得硝化反应只能在自养型细菌作用下进行和反硝化反应只能在厌氧情况下进行的观念。

1.3.2　氨化细菌

在农田土壤中，含氮化合物存在的主要形式有有机氮和氨态氮，一般以前者为主。有机氮化合物在氨化细菌作用下，即氨化作用下，分解、转化为氨态氮，从而转化为植物可利用的氨氮。一些含氮有机物在氨化菌细胞外蛋白酶的水解作用下发生转化，变成氨基酸，之后进入到细胞从脱除氨基到生成氨的过程即为氨化作用，氨化作用对溶解氧要求很广泛，厌氧或好氧条件下均可进行。

目前分离到的氨化微生物种类非常繁多，细菌中主要有芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta）、粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）等。相应的也有真菌和放线菌等微生物，但由于细菌繁殖快且易培养，成为了研究最普遍的氨化菌。氨化菌的氨化速率受环境因子pH值、温度及溶解氧的影响，氨化菌能适应的pH值范围较宽泛，一般在6.5～8.0内，就可达到很好的氨化效果。氨化菌适应的温度范围一般是25～40℃，如果温度过低，氨化作用就会进行缓慢，但过高了又会影响蛋白酶活性。对于好氧氨化作用，溶解氧含量的高低直接影响反应的进行。

1.3.3　硝化细菌

按照菌的营养来源，硝化细菌可分为两类，即自养型的硝化细菌和异养型的硝化细菌。硝化细菌大多是自养型细菌，虽然异养硝化细菌的硝化效果不如自养的理想，但异养硝化细菌有着分布广、适应性强、繁殖快、易获得等优点，从而让人们越来越倾向于发现效果较好的异养硝化菌。

自然界中存在的自养硝化细菌有硝化杆菌属（Nitrobacter）、亚硝化叶菌属（Nitrosolobus）、亚硝化螺菌（Nitrosospira）、硝化球菌（Nitrococcus）等。在异养硝化细菌的研究方面，目前已知的菌属主要有：芽孢杆菌属（Bacillus）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、微球菌属（Micrococcus）、不动细菌属（Acinetobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）等。影响硝化作用速率大小的环境因子主要有pH值、温度、溶解氧、C/N等。有研究表明硝化细菌的最适pH值为7.0～8.5，最适宜的生长温度为30℃左右；对于异养硝化细菌，C/N越高，其硝化活性就越强。

1.3.4　异养硝化好氧反硝化细菌

异养硝化好氧反硝化，其实是一种可实现同步硝化反硝化的手段，是由一种可同时具有硝化、反硝化功能的脱氮功能微生物来完成。近年来，国内外学者通过研究认为异养硝化好氧反硝化是最经济的脱氮手段。最早的有关异养硝化好氧反硝化的报道是1983年Robertson和Kuenen筛选分离出的一株有异养硝化好氧反硝化的Thiosphaera pantotropha菌。还有研究表明，这种菌在好氧生长结束后亚硝态氮的积累达到最大，随后又迅速降低，以此证实异养硝化好氧反硝化细菌的存在。国内外大部分研究均显示，异养硝化好氧反硝化菌以氨氮为唯一氮源，在降解过程中，随着氨氮浓度的降低，亚硝态氮和硝态氮的积累不明显，从而对避免出现较高的硝态氮和亚硝态氮的积累有很重要的意义。

国内外大量文献均报道了异养硝化好氧反硝化细菌，即同步硝化反硝化的相关研究及实际应用情况，其中应用最多的是在废水和污泥的脱氮处理方面。目前已知的异养硝化好氧反硝化细菌有假单胞菌属（Pseudomonas）和产碱杆菌属（Alcaligenes）等。

1.3.5　微生物菌剂的相关研究

固定化微生物技术是使用物理的或化学的方法和原理将具有某种特定生理功能的游离态的微生物固定到载体材料的内部或表面，并加以有效利用。近年来，很多研究者采用固定化技术和微生态制剂的方法来构建脱氮功能菌群，将其应用于修复氮污染的水体中，并取得了一定成效。研究表明，固定化技术明显增强了微生物对环境的适应能力和对污染物的去除能力，同时大大提高了土壤的修复效果，是一种潜力很大的土壤修复技术。

固定化方法有很多，主要是以物理吸附法和包埋法为主。其中，吸附法的原理是把菌种吸附在载体的表面，所用的载体一般具有传质性好、比表面大、性质稳定、价格低廉等特点。常用载体有硅藻土、蛭石、珍珠岩、陶粒、多孔玻璃等。吸附法操作简单，对菌的活性不会产生较大的影响，但能固定的微生物数量是有限的。包埋法的原理是把微生物限定在有限的空间内，而又不会阻止基质和产物通过。常用载体为高分子凝胶如纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂等。菌剂活性是衡量菌剂质量好坏的一个重要指标，也就是说单位体积或单位质量的活的有效菌的数目越多，就越利于菌剂的保存，也就可以更好地将其在应用在污染的土壤或水体中。

微生物吸附在土壤颗粒上形成生物膜是一种非常普遍的自然现象。应用于土壤的固定化技术中的载体材料不仅是微生物的附着剂，又能给之提供一个良好的缓冲体系，最重要的是，载体为微生物提供足够的营养，并能提高土壤微生物的活性和密度，这就要求应用在土壤修复中的载体材料需要有一定的可生物降解性。所以，固定化微生物技术应用于修复污染土壤中，选择合适的载体材料就显得非常重要。

微生物菌剂在欧美日等发达国家研究较为深入，市场推广较早，相关技术更成熟，因此目前在发达国家的应用要更为普遍。20世纪80年代以后，我国才开始关于微生物菌剂的研究。由于土壤环境本身的非均质性和复杂性，利用这项技术修复污染土壤的主要难题在于固定化载体的选择以及适合修复该土壤的优势菌种的筛选。通过选择固定化载体将菌种制成菌剂，具有重大的研究意义。国内环保类微生物菌剂的使用量有明显的增长趋势，据不完全统计，2007年菌剂用量为200t，2008年为230t，2009年为275t，2010年则达到350t。综合来看，国内市场的环保用菌剂主要有三个来源：一个是从国外进口，其份额占总量的60%以上；一个是由本国企业生产，占市场份额的30%左右；还有一种是来源于国内高校和科研院所开发生产，约占5%～10%的份额。