1.5　高通量测序

近年来，对土壤微生物结构变化特征进行研究，以预测土壤生态系统结构与功能也越来越受到人们的普遍关注。一般来说，微生物繁殖较快、体积很小、适应能力强，没有方法对复杂的自然环境中的微生物生理过程和生态过程进行定量的表征，对环境干扰的适应和响应的机制也大都处于最基础的描述阶段。尽管对微生物的研究存在很多限制性的问题，但由于微生物都具有自身的遗传基因，所以利用分子生物学弥补了传统微生物培养方法的不足。

随着现代分子生物学技术（如分子杂交、DNA指纹图谱、稳定性同位素探测、高通量测序技术等）的不断发展和改进，土壤微生物多样性的研究也进入了新时期。高通量测序（High-throughput sequencing）技术是最新发展起来的现代分子生物学技术，又称为下一代测序（Next-generation sequencing，简称NGS）技术，是目前主要流行的测序方法，以一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。

目前主流高通量测序平台分别为Roche 454焦磷酸测序、Illumina/Solexa合成测序和ABI SOLiD连接法测序。2005年454公司推出了第一个基于焦磷酸测序原理的高通量测序系统，依靠生物发光进行DNA序列分析，主要应用于denovo测序，但测序成本相对较高。Illumina/Solexa测序是当前应用最广泛和实用性最强的新一代测序技术，它推出的Hiseq是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理，其中Hiseq2000和Hiseq2500具有高通量、高准确性、高自动化、高灵敏度、低运行成本低等突出优点，主要应用于RNA测序和表观遗传学研究。ABI SOLiD测序技术与其他高通量测序平台相比，oligo连接测序是通过连接酶链接，再对oligo上荧光基团进行检测。该技术最大的特点是具有高通量和高精度，在测序反应进行的同时，收集反应信号，降低了测定成本。

高通量测序技术具有传统测序方法不具备的优点，比如利用芯片可以同时在数百万个点上测序，定量功能较好等。该方法越来越被广泛接受，它可以在种的水平上分析土壤微生物的群体构成或基因的组成以及功能，为微生物的多样性分析研究做出贡献。

利用高通量测序，能够针对某个菌种，测定出上百株细菌的基因组序列，为分类全基因组信息提供技术基础。应用高通量测序技术对各种环境微生物的研究在很大程度上提高了对环境中微生物多样性的认识，探索出了未知的环境微生物及其功能。