第三节　其他新技术应用

一、色谱与质谱联用技术

色谱与质谱联用进行中药定量分析，是近年来发展很快的一项新技术，尤其是液相色谱与质谱联用技术的发展，对于很多热不稳定化合物及无紫外吸收的微量成分的定量分析具有重要意义。

（一）概述

色谱与质谱联用技术在中药分析中的应用主要是在复杂化合物的定性研究方面。色谱是一种很好的分离手段，可以将复杂化合物的各组分分开，当其与质谱技术相结合时，即可以实现化合物的定性分析。对于很多常规的检测技术难以达到定量目的的微量活性成分，尤其是对于没有紫外吸收的微量成分，质谱与色谱联用技术的发展不仅满足了人们对化合物定性方面的需要，也使痕量化合物的定量成为可能。

气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）起始于20世纪50年代后期。1957年J.C.Homlmesh和F.A.Morrell首次实现GC-MS联用。1965年出现第一台商品仪器，1968年实现与计算机联用，使得该技术得到长足的发展。质谱仪根据化合物碎片离子的质荷比和碎片离子的相对丰度，利用智能分析软件，对于给出的质谱图，进行智能解析，从而确定分子量、分子式，判断化合物的组成成分，并进行定性和定量分析。在所有的联用技术中，气-质联用发展的最完善，应用最广。GC-MS主要适用于分析沸点较低、热稳定性好的化合物。

高效液相色谱-质谱联用技术的研究起始于20世纪70年代，与GC-MS联用技术比较，液-质联用技术的发展遇到两个核心技术问题，一是真空的匹配，二是接口技术，其经历了一个更长的研究过程，在解决了真空、接口等技术之后，90年代才开始出现了被广泛接受的商品化仪器。HPLC与串联质谱联用可在一级质谱条件下获得很强的待测物准分子离子峰，并可借助MSn（n=2～10）对准分子离子进行多级裂解，从而获得丰富的化合物碎片信息，以判断化合物的结构，辨认重叠色谱峰以及在背景或干扰物存在的情况下对目标化合物定量分析。近年来，LC-MSn（n=1～10）在药物分析领域的应用十分广泛。

（二）方法原理

1.色谱法基本原理

详见本章第二节。

2.质谱法的基本原理

质谱法主要是通过对样品离子的质荷比进行分析，实现对样品定性和定量的一种分析方法。样品进入质谱仪，在质谱仪离子源中，化合物被电子轰击，电离成分子离子和碎片离子，这些离子在质量分析器中，按质荷比大小顺序分开，经电子倍增器检测，即可得到化合物的质谱图，一般质谱图的横坐标是质荷比，纵坐标是离子的强度。离子的绝对强度取决于样品量和仪器的灵敏度；离子的相对强度和样品分子结构有关。同一样品，在一定的电离条件下得到的质谱图是相同的，这是质谱图进行有机物定性分析的基础。GC-MS由于在EI电离方式下，任何公司生产的仪器都可以获得很好的质谱图重现，因此其具有了标准的图谱库，方便科研工作者的应用。液-质联用仪常用电离源有大气压化学电离源和电喷雾电离源，得不到可供检索的标准质谱图，不能进行库检索定性，只能提供分子量信息，可通过采用串联质谱仪获取碎片信息，用来推断化合物结构。

高分辨率的质谱仪，可以精确测定分子离子或碎片离子的质量，依靠计算机可以计算出化合物的组成式，对于化合物的定性很有帮助。分析出化合物的特征离子后，即可通过提取特征离子谱图进行定量分析，总离子流可以与UV图对照，而基峰离子流能更清晰地反映分离状况，特征离子的质量色谱在复杂化合物分析及痕量分析时是LC-MS测定中最有用的谱图，它既有保留值信息，又具备化合物的结构特征，抗化学干扰性能好，常用于定量分析，尤其是对于在UV图谱中不能获得完全分离的样品，具有独特的优势。

（三）仪器结构与原理

色谱质谱联用仪是实现样品分离及检测过程的仪器，结合了色谱高效分离和质谱高灵敏度检测的优点，可以实现复杂微量物质的在线检测。无论哪种性质的色谱-质谱联用仪，其三个基本组成部分都是相同的，即色谱分离系统、质谱检测系统和数据处理系统，其主要构成如图2-3所示。

1.色谱系统（进样系统）

色谱系统是构成色谱-质谱联用仪的重要组成部分，是把分析样品导入离子源的装置，其可以是气相色谱、液相色谱，也可以是各种类型的毛细管电泳，这部分内容可以参考前面有关的章节。由于要与质谱联用，在流动相组成、色谱条件等方面与常规的色谱法之间存在一定的差别，尤其是液-质联用时，在色谱柱、流动相的选择上与常规液相法都有一些区别，这一点会在后面作详细的介绍。

2.质谱系统

质谱仪是色谱-质谱联用仪中实现被分离样品在线检测的重要部分，根据质谱所提供的信息，可以对复杂化合物进行定性和定量分析。无论色谱-质谱联用仪的类型如何变化，构成质谱系统的5个基本组成部分都是相同的，即接口、真空系统、离子源、检测系统及数据处理系统。

（1）真空系统　质谱仪除了记录和显示系统外，其他各个部分都必须在不同的高真空度下工作。真空系统是由机械真空泵（前极低真空泵）和扩散泵或分子泵（高真空泵）组成的二级真空系统，由其抽取离子源和分析器部分的真空。只有在足够高的真空度下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够，会造成离子源灯丝损坏，本底增高，电离室中加速及发生火花放电等一系列问题，从而使仪器灵敏度降低，图谱复杂化。

（2）电离源　电离源是将进样系统引入的被分析样品分子转化为带电粒子（离子），并对离子进行加速使其进入分析器的装置。根据离子化方式的不同，电离源又可分为很多种。常用的电离源有电子轰击离子源（electron impact ionization，EI）、化学电离源（chemical ionization，CI）、大气压化学电离源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）、电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）、光化学电离源（APPI）、基质辅助激光解析电离源（matrix assistedlaser desorption ioni-zation，MALDI）、电感耦合等离子体源（inductively coupled plasma，ICP）和快原子轰击源（fast atom bombardment，FAB）等。由于各种电离源能量大小不同，应用的对象也不同，在气相色谱-质谱联用仪中，EI和CI是最主要的电离方式，在液相色谱-质谱联用仪中，目前市场上商品化的仪器中主要配置了ESI和APCI两种高效的软电离电离源。

（3）质量分析器　质量分析器是质谱仪中将离子按质荷比分开的部分。样品分子在电离源离子化后，经加速、聚焦被送入质量分析器，在质量分析器中，离子按不同质荷比（m/z）被分开，依次进入检测器，相同的m/z离子聚焦在一起，组成质谱图。

现代质谱仪的分析器有很多种，不同的分析器在分离原理、质量范围、分辨本领等各个方面都不同，可以适用于不同的分析样品。常用的质量分析器有：单聚焦质量分析器（single focusing mass analyzer）、双聚焦质量分析器（double focusing mass analyzer）、四极质量分析器（quadrupole mass analyzer）、飞行时间质量分析器（time of flight mass analyzer）、离子阱质量分析器（ion trap mass analyzer）和离子回旋共振质量分析器（ion cyclotron resonance mass analyzer）等。在这些质量分析器中，气相色谱中应用最多的是四极杆，与液相色谱联用中较常用到的有四极杆质谱、飞行时间质谱、离子阱质谱及多级质谱（三重四极、TOF+TOF及四极+TOF、磁式+TRAP等混合型串联式多级质谱仪）。

（四）液相色谱-质谱定量方法研究

大多数质谱定量工作是基于比较样品中待测成分的离子流和内标物的离子流。记录离子流的方法通常为选择性离子监测（selected ion monitoring，SIM）。多数定量工作是采用LC-MS或GC-MS技术。

在所有的质谱仪中，四极杆质谱仪是与色谱仪器联用时应用的最为广泛的MS仪器，单四极杆质谱仪的主要优点是相对可靠，具有优良的性价比，适合于定性、定量分析。通常用单四极杆质谱仪做定量分析时采用离子监测模式（selected ion monitoring，SIM）。检测限取决于能否将目标化合物与样品中的其他化学成分包括背景干扰加以区别。在对未知化合物的定性研究中，单级四极质谱明显不如串联质谱（三重四极质谱、离子阱质谱）具有优势，但是单四极杆质谱SIM模式的灵敏度要远高于离子阱质谱。Kevin C.Crellin等人的研究表明：即使在分析复杂的生物样品时（牛奶提取物等），采用SIM模式进行定量的检测限（LOD）仍可达pg级，虽然仍高于三重四极质谱仪的LOD，但要远低于离子阱质谱仪的LOD。

液相色谱与串联质谱（多级质谱）联用技术目前在中药和天然产物研究中的应用研究日渐增多，在液相色谱分离的基础上，多级串联质谱不仅可以给出化合物的分子量，还可以提供有关化合物的结构类型等信息，其在天然产物的结构鉴定、定性与定量分析研究方面的应用日益引起重视。串联质谱仪的应用成功地弥补了ESI等软电离方式缺乏样品结构信息的缺陷。ESI、APCI、MALDI这三种离子化方法和FAB等方法均属于软电离方式，其中ESI是目前最温和的一种电离方式，通常它的能量在2～5e V，非常适合分析中等极性、高极性和热不稳定的化合物。但是ESI-MS多数情况下只能给出准分子离子峰，很少给出碎片离子峰，不能提供更多的化合物的结构信息，不利于进一步的结构解析。因此串联质谱采用适当的活化方法，使前体离子裂解，得到大量的碎片结构信息。目前常用的MS-MS技术多采用碰撞诱导解离（collision induced dissociation，CID），又称碰撞活化解离（collision activated dissociation，CAD）技术，利用惰性气体和离子相碰撞，使离子内能增加，从而发生裂解反应。

借助CID等活化技术，串联质谱法可进行4种扫描工作方式：a.产物离子扫描，包括选择前体离子和测定由CID产生的所有产物离子，通过产物离子谱可以解析碎片峰的可能组成，从而获得分子的结构信息；b.前体离子扫描，包括选择某一产物离子和测定所有能经CID产生这一产物离子的前体离子，快速筛选产生某种特征碎片离子的一类化合物；c.中性丢失扫描，包括选定中性碎片，检测所有能丢失这一中性碎片的裂解反应，从而反映该化合物的官能团情况；d.选择反应监测（selected reaction monitoring，SRM），此时，第一个质量分析器选定一个离子，这个离子经碰撞池产生碎片离子，然后由后一个质量分析器选择特征离子进行监测。当选定多对前体-产物离子进行选择反应监测时即为多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）。这种扫描方式适合于复杂体系中对目标化合物的快速筛选和鉴定，可大幅提高信噪比，特别是对复杂体系的定量分析。

近些年药物学家又尝试开发TOF MS在药物代谢物定量分析等方面的应用。Zhang hongwei等同时采用LC-TOF MS和TQ MS的SRM模式对人血浆中idoxifene进行定量分析，并将两种方法的验证结果进行比较：TOF MS的定量限（5ng/mL）较SRMTQMS的定量限（0.5ng/mL）高10倍；TOF MS的线性动态范围为5～2000ng/mL，SRM TQ MS的为0.5～1000ng/mL；精密度、重复性与SRM TQ MS的相似，在可接受的范围内。TOF MS定量的优点还在于数据采集速度快、全谱灵敏度高，适合于生物样品的高通量分析、快速色谱分离。但作者同时指出：相比于SRMLC-MS，LC-TOF MS对于所分析的目标化合物要求有足够的色谱分离度。

（五）实验技术

由于气相色谱-质谱法应用较早，经过40余年的发展，其色谱柱、接口及质谱仪选择等技术均已成熟，在这里主要介绍液-质联用的实验技术。

采用质谱定量分析，必须遵循先定性后定量的原则。进行含量测定之前必须了解样品的其他信息，例如熔点、沸点、溶解性等理化性质，样品来源，光谱、波谱数据等，可能的杂质，LC条件，色谱柱类型、规格、流动相、流速，样品含量等。定量前一定要摸好LC条件，同时对于待测组分的质谱裂解性质要有充分的了解。

1.电离源及正负离子模式的选择

电喷雾电离源是一种软电离方式，即便是分子量大、稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解，它适合于分析极性强的大分子有机化合物，如蛋白质、肽、糖等。电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。这样，一个分子质量为10000Da的分子若带有10个电荷，则其质荷比只有1000Da，进入了一般质谱仪可以分析的范围之内。根据这一特点，目前采用电喷雾电离，可以测量分子质量在300000Da以上的蛋白质。

大气压化学电离源主要用来分析中等极性的化合物。有些分析物由于结构和极性方面的原因，用ESI不能产生足够强的离子，可以采用APCI方式增加离子产率，可以认为APCI是ESI的补充。APCI主要产生的是单电荷离子，所以分析的化合物分子质量一般小于1000Da。用这种电离源得到的质谱很少有碎片离子，主要是准分子离子。

APCI与ESI源都能分析许多样品，而且灵敏度相似，很难说出哪一种更合适，至今没有一个确切的准则判断何时使用某一种电离方式更好。但是通常认为ESI源由于能产生一系列的多电荷离子，特别适合于蛋白质、多肽类的生物大分子及其他分子量大的化合物；APCI源不能生成一系列多电荷离子，所以不适合分析生物大分子，而更适合于分析极性较小的化合物。

根据样品性质确定离子化方式：高极性化合物或大分子，如蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子，胺类、季铵盐等，含杂原子化合物如氨基甲酸酯等，适合ESI（IS）。弱极性/中等极性的小分子，如脂肪酸、邻苯二甲酸等，含杂原子化合物如氨基甲酸酯、脲等，适合APCI（HN）。ESI不能用于极端非极性化合物如苯等；APCI不能用于非挥发性样品、热稳定性差的样品。

另外，利用色谱-质谱系统进行定量分析时，首先要选择正负离子测定模式。选择的一般性原则为：碱性化合物宜用正离子方式，酸性化合物宜用负离子方式；如为未知化合物，正负离子模式都要做；有些化合物正负离子模式下都出峰，则选择灵敏度高的方式。

2.特征离子的选择

特征离子的质量色谱在复杂混合物分析及痕量分析时是LC/MS测定中最有用的谱图，当样品浓度很低时LC的TIC上往往看不到峰，此时，根据上一步得到的分子量信息，输入M+1、M-1或M+23等特征离子的数值，观察提取离子的质量色谱图，检验直接进样得到的信息是否在LC-MS上都能反映出来，确定LC条件是否合适，然后进行测定。特征离子选M+H或M-H最好，但有时只有M+NH4，M+Na等。

3.流动相和色谱柱及内标的选择

进行质谱定量前一定要摸好普通液相的条件，被分析物质在液相中要能够达到基本分离。缓冲体系必须符合MS要求，采用挥发性缓冲液，如醋酸铵、甲酸铵、乙酸、三氟乙酸（TFA）、七氟丁酸（HFBA）等代替硼酸盐、磷酸盐和硫酸盐等，pH值应保持相同；应采用挥发性的离子对试剂，但应注意更换离子对试剂后保留时间的变化；液相用的有机溶剂应与离子化方式一致。反相LC用的极性溶剂与ESI相匹配；正相LC用的非极性溶剂与APCI相匹配。

如果选择电喷雾（ESI）离子源，建议使用内径小于4.6mm的微径柱，如果选择大气压化学电离源（APCI），建议使用内径为4.6mm的色谱柱。

内标物与被测物的化学性质有区别时，要注意干扰基质对它们的离子化影响的不同，尽量选同系物作为内标物。

4.样品前处理

为了防止分析样品中的微量颗粒堵塞质谱内部系统，在进行定量分析前，样品必须进行前处理。样品的预处理常用方法有超滤、溶剂萃取/去盐、固相萃取、灌注（perfusion）净化/去盐、色谱分离等。将待测成分自水相提取至有机相是常用的方法之一，这种方法的优点是应用广泛，溶剂、pH值、离子对试剂等均可选择，以利提取，可浓集待测成分，缺点是耗时，有时回收率较低。固相萃取是质谱前处理中应用最多的方法，主要是使用C18、C8、C4萃取小柱。对于已经处理好的待测样品，若原来溶剂不合适，以N2吹干，再用甲醇或乙腈定量溶解。进样前，样品还要经过0.22μm的微孔滤膜进行过滤。

实例解析

下面以利用ESI/QMS方法测定牛膝中活性物质的含量为例，来介绍质谱定量检测的具体步骤，MS分析使用Agilent SLG1946D单四极杆质谱仪（USA）。

首先对需要检测的4种甾酮类化合物：水龙骨甾酮（polypodine，1），β-蜕皮甾酮（β-ecdysterone，2），25-R牛膝甾酮（25-R inokosterone，3），25-S牛膝甾酮（25-Sinokos-terone，4）及8种三萜类化合物：人参皂苷Ro（ginsenoside Ro，5），竹节参皂苷Ⅳa（chikusetsusaponin Ⅳa，6），姜状三七苷R1（zingibroside R1，7），竹节参皂苷Ⅳa乙酯（chikusetsusaponin Ⅳa ethyl ester，8），28-去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa（28-deglucosyl-chiku-setsusaponin Ⅳa，9），竹节参皂苷-1（PJS-1，10），28-去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa丁酯（28-desglucosyl-chikusetsusaponin Ⅳa butyl ester，11），齐墩果酸（oleanolic acid，12）的对照品进行正、负离子模式扫描，得到每个化合物的质谱信息，并最终确定选择在负离子模式下进行实验。然后以峰面积为指标，分别选取代表性化合物，对两类物质进行负离子模式下的流动注射质谱分析，通过优化质谱参数（如干燥气温度、雾化压力、传输电压等），确定最佳的离子源参数，并在此参数条件下找出4种甾酮类及8种三萜类化合物的质谱裂解规律（表2-4，图2-4）。例如，在负离子模式下，化合物1，2，3，4和10的加合离子［M-H+HCOOH］-基峰，甾酮类成分同时还可观察到［M-H］-及［2M-H］-离子。化合物8和10还可观察到［M-Glc］-离子的分子离子峰，化合物5，6，7和9，11，12［M-H］-离子为基峰，没有观察到加合离子［M-H+HCOOH］-，化合物12可观察到［2M-H］-峰。

注：*为基峰。

在优化了质谱条件的基础上，选取合适内标，对内标与对照品的混合物进行色谱条件的优化。优化色谱条件时，可以充分发挥HPLC-ESI/QMS的技术优势，利用待分析化合物的分子量及裂解规律不同的性质，使得在色谱条件下未完全分离的目标化合物与干扰物成功地分离，达到定量分析要求，即采用多通道对样品数据进行采集和分析。如图2-5所示，化合物1和2在色谱条件下并没有达到基线分离，但因其分子量不同、特征加合离子［M+HCOOH-H］-的m/z没有干扰，化合物1为541.3；化合物2为525.3，可以采用多通道对样品数据进行采集和分析，其结果如表2-5所示，大大缩短了分析时间。

以上步骤完成之后，以峰面积与标准品浓度线性关系绘制标准曲线，并以峰面积为指标，确定仪器的检测限、定量限、精密度、稳定性以及方法的加样回收率等，并以待测样品的选择离子流图（SIM）对目标化合物的含量进行分析计算。

附1　Agilent7890/5975C-GC/MS仪器操作规程

①打开氦气和氮气控制阀，设置分压阀压力至0.5～0.7MPa；

②打开计算机电源，登录进入Windows XP（SP2）系统；

③分别打开7890GC、5975MSD电源，等待仪器自检完毕；

④在桌面双击“Instrument#1”图标，进入MSD化学工作站；

⑤在仪器控制界面下，选择“调谐及真空控制”进入调谐与真空控制界面，选择真空状态，观察真空泵运行状态；

⑥点击配置按钮，点击，选择输入注射器的体积1μL，由仪器自动进样；

⑦点击，设定进样口温度、载气流速；

⑧点击，设定检测器温度；

⑨点击，设定柱参数、气流速，控制气流量；

⑩点击，设定柱模式，对柱箱温度的设置；

开始运行，并得到谱图，保存在文档备用；

用右键双击化合物的谱图，得到该化合物的质谱图；

双击鼠标右键，即可得到该谱图在所选谱库中的检索结果；

关机，先将离子源、接口、进样口及柱箱温度降低（100℃），在操作系统“Instru-ment#1”图标进入工作站，选择“vent/放空”，40min后，关窗口，关质谱和色谱电源和计算机，关闭氦气和氮气。

二、其他定量分析方法

（一）毛细管高效液相色谱

毛细管高效液相色谱（CHPLC）（色谱柱内径为0.1～0.5mm）及其质谱联用技术，以其独特的优点，作为化学及生命科学分析的重大革命性进步，引起了世界范围内的广泛关注。

毛细管高效液相使用的毛细管色谱柱较常规色谱柱内径更小，对于同样的进样量峰高与柱横断面积成反比，因此，可以得到更高的峰值，而更高的峰值对于质谱或者其他检测器便有更低的检测限，即提高了灵敏度。毛细管高效液相采用可供微量组分推送的注射泵（syringe pump），克服了传统HPLC利用塞泵（piston pump）而无法做微量推送的困扰，并且采用管径仅0.5mm的毛细管管柱（capillary column）以减少传送时的流量。对于UV检测器部分采用U形管使流路检测面积增大，提高了各组分的检测灵敏度。大多情况下，能够得到的可供分析的生物样本极其微量（例如临床和生物利用度的研究），样品的浓度很低，需要更高选择性、灵敏度的分析设备，例如血清样品在进行普通HPLC分析之前的预处理极其繁复，而毛细管高效液相对于生物样品可以直接进样分析，灵敏度必然提高。

毛细管液相目前主要应用于蛋白组学、生物分析以及高通量筛选上。微量进样使得一系列高灵敏度的检测器（如光敏二极管阵列检测器、质谱仪、激光诱导荧光检测器）与毛细管高效液相色谱联用时，样品检测浓度可达到ng级水平或者更低。由于毛细管高效液相对于极低浓度的样品的高度灵敏性，现已广泛应用于蛋白水解液2Dgelisolates、微量DNA加合物以及药物前期研究的神经递质分析和生物分析。

（二）毛细管电色谱

毛细管电色谱（capillary electrochromatography，CEC）是一种新型的高效电分离微柱液相色谱技术，它结合了毛细管电泳的高柱效和高效液相色谱的高选择性，已成为近年来色谱领域研究的热点之一。CEC以高压直流电源代替高压泵，产生电渗流（或电渗流结合高压输液泵），作为流动相驱动力的微柱色谱法，它的分离原理包含有电泳迁移和色谱固定相的保留原理，溶质依据其在流动相与固定相中的分配系数的不同以及自身电泳淌度的差异得到分离，既能分离中性物质又能分离带电组分。CEC所用色谱柱为填充了HPLC填料的填充型毛细管柱（PCEC）和管内壁涂渍了固定相功能分子的开管毛细管柱（OTCEC）。CEC结合了CE与HPLC的分离优势，大大提高了分离效率，同时CEC与质谱联用既可解决LC-MS的分离效率不高的问题，又可克服CE-MS中质量流量太小的缺陷，是复杂微量组分定性定量的有利工具，在中药质量控制中得到广泛应用。

（三）超高效液相色谱法

超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）是一个新兴的领域，它借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。作为世界第一个商品化UPLC产品的Waters ACQUITY UPLCTM超高效液相色谱系统也是刚刚出现，目前已发表的文献资料还很缺乏。与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。因此其在蛋白质、多肽、代谢组学分析及其他一些生化领域里将会得到广泛应用。另外，使用UPLC与质谱检测器连接，对天然产物分析，特别是对中药研究领域的发展是一个极大的促进。

（李　娟）

参考文献

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