第一节 基本原理
一、溶液的颜色
人眼能够观察到的那一小波段电磁波称为可见光。在可见光区内，不同颜色的光具有不同的波长，但不同色光之间并没有严格的界限，而是由一种颜色逐渐过渡到另一种颜色，各种颜色光的近似波长范围，如表4-1所示。
表4-1 各种色光的近似波长范围
在可见光区红色光的波长最长，紫色光的波长最短。
知识拓展
紫外光区和可见光区的波长
波长在200～400nm近紫外光区的光称为紫外光（也称紫外线），波长在400～760nm的光称为可见光。光的波长越长，其能量越小；光的波长越短，其能量越大。
具有单一波长的光称为单色光；由不同波长的光混合而成的光称为复合光。例如，白光（日光和白炽灯光）就是由各种不同颜色的光按照一定比例混合而成的。如果让一束白光通过棱镜，就能散射出红色、橙色、黄色、绿色、青色、蓝色、紫色等各种颜色的光，这种现象称为光的色散。
如果将两种适当颜色的单色光按一定强度和比例混合可以得到白光，这两种单色光互称互补色光，如图4-1所示。例如，紫色光和绿色光互称为互补色光；蓝色光和黄色光互称为互补色光。白光就是由很多对互补色光按一定强度和比例混合而成的。
图4-1 光的互补色示意图
溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的质点（分子或离子）选择性地吸收了白光中某种颜色的光而引起的。当一束白光通过某溶液时，如果该溶液对任何颜色的光都不吸收，则溶液无色透明；如果该溶液对任何颜色的光的吸收程度相同，则溶液灰暗透明；如果溶液吸收了其中某一颜色的光，则溶液呈现透过光的颜色，即呈现溶液所吸收色光的互补色光的颜色。例如，高锰酸钾溶液能够吸收白光中的绿色光而呈现紫色。再如，硫酸铜溶液能够吸收白光中的黄色光而呈现蓝色。
课堂互动
请您想一想，一束白光透过红色玻璃片后，何种颜色的光被吸收了？何种颜色的光几乎不被吸收？
二、透光率与吸光度
用一束平行的单色光垂直照射均匀无散射的溶液，若入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，反射光强度为Ir，则它们之间的关系为：
I0=Ia+It+Ir （4-1）
在分光光度法中，通常把待测物质溶液和参比溶液分别置于相同材质和相同厚度的吸收池中，所以，两个吸收池的反射光强度基本相同且可以忽略不计，如图4-2所示，则上式可以简化为：
图4-2 光线照射溶液示意图
I0=Ia+It （4-2）
透射光强度It与入射光强度I0的比值称为透光率或透光度（tranmitance），用符号T表示，即：
溶液的透光率越大，表示它对光的吸收程度越小；溶液的透光率越小，表示它对光的吸收程度越大。透光率T的倒数能够反映溶液对光的吸收程度。在实际应用时，对透光率的倒数取对数，称为吸光度（absorbance），常用A表示，所以，透光率和吸光度之间的关系为：
则 T=10-A （4-5）
溶液的吸光度具有加和性。如果溶液中同时存在两种或两种以上的吸光性物质，则测得的吸光度等于各吸光性物质吸光度的总和，即：
Aa+b+c=Aa+Ab+Ac （4-6）
这是分光光度法对多组分溶液进行定量分析的理论基础。
三、光的吸收定律
朗伯（Lambert）于1760年研究了有色溶液对光的吸光度（A）与液层厚度（L）的关系，得出的结论是：当一束平行的单色光通过均匀无散射的溶液时，如果溶液的浓度保持恒定，在入射光的波长、强度及溶液的温度等不改变的条件下，则该溶液的吸光度（A）与液层厚度（L）成正比，即：
A=k1L （4-7）
这一结论称为朗伯定律（Lambert law）。
比尔（Beer）于1852年研究了有色溶液对光的吸收度（A）与溶液浓度（c）的关系，得出的结论是：当一束平行的单色光通过均匀无散射的溶液时，如果溶液的液层厚度保持恒定，在入射光的波长、强度及溶液的温度等不改变的条件下，则该溶液的吸光度（A）与溶液的浓度（c）成正比，即：
A=k1c （4-8）
这一结论称为比尔定律（Beer law）。
如果同时考虑溶液的液层厚度（L）和溶液的浓度（c）两个因素，上述的两个定律就合并为朗伯-比尔定律（Lambert-Beerlaw），也称为光的吸收定律，可以表述为：当一束平行的单色光通过均匀、无散射的溶液时，在入射光的波长、强度及溶液的温度等条件不变的情况下，该溶液的吸光度（A）与溶液的浓度（c）和液层厚度（L）的乘积成正比，即：
A=kLc （4-9）
式（4-9）中的k在一定条件下是常数，称为吸收系数（absorptivity）。
朗伯-比尔定律不仅适用于可见光，而且也适用于紫外光和红外光；不仅适用于均匀、无散射的溶液，而且也适用于均匀、无散射的固体和气体。朗伯-比尔定律是各类分光光度法进行定量分析的理论基础。
【例4-1】某化合物溶液遵守朗伯-比尔定律，当浓度为c1时，透光率为T1，试计算当浓度为0.5c1和2c1时，在测定条件不变的情况下，相应的透光率分别为多少？何者最大？
解：根据比尔定律 A=-lgT=kc
当浓度为c1时 
当浓度为0.5c1时 
当浓度为2c1时 
0<T<1
T2为最大
答：当浓度为0.5c1时，透光率最大。
四、吸收系数
如果被测物质溶液浓度的单位不同，则吸收系数的物理意义和表达方式也不同，吸收系数通常用以下几种方法来描述。
1.摩尔吸收系数
在入射光波长一定时，溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时所测得的吸光度称为摩尔吸收系数，常用ε表示，其量纲为L/（mol·cm）。
通常将ε≥104时称为强吸收，ε<102时称为弱吸收，ε介于两者之间时称为中强吸收。
2.百分吸收系数
在入射光波长一定时，溶液浓度为1％（g/100mL）、液层厚度为1cm时所测得的吸光度称为百分吸收系数，也称为比吸收系数，常用
表示，其量纲为100mL/（g·cm）。
3.摩尔吸收系数与百分吸收系数的换算
根据上述定义，摩尔吸收系数和百分吸收系数之间的换算关系是：
式（4-12）中的M是吸光性物质的摩尔质量。
ε和
通常不能直接测定，而是通过测定已知准确浓度的稀溶液的吸光度，根据朗伯-比尔定律计算求得。
当入射光的波长、溶剂的种类和溶液的温度等因素确定时，ε和
只与物质的性质有关，是物质的特征常数之一，可以标示物质对某一特定波长光的吸收能力。不同物质对同一波长单色光，可以有不同的吸收系数；同一物质对不同波长的单色光，也会有不同的吸收系数。因此，在使用吸收系数时，一定要注明入射光的波长。
ε和
越大，表明相同浓度的溶液对某一波长的入射光越容易吸收，测定的灵敏度越高。一般ε值在103以上时，就可以进行分光光度法定量测定。
【例4-2】用安络血（相对分子质量为236）纯品配制100mL含安络血0.4300mg的溶液，以1cm厚的吸收池在λmax=355nm处测得其吸光度A值为0.483，试求安络血在355nm的
和ε值。
解：根据朗伯-比尔定律，
答：安络血在355nm的
和ε值分别为1123mL/（g·cm）和2.65×10-4L/（mol·cm）。
五、偏离光的吸收定律的因素
应用光的吸收定律进行吸光度分析时，常用标准曲线法来进行定量分析或检查待测溶液是否遵循朗伯-比尔定律。
其方法是：首先配制一系列不同浓度的标准溶液，在一定条件下进行显色，固定吸收池厚度，在一定波长时分别测定各溶液的吸光度，然后以吸光度（A）为纵坐标，以浓度（c）为横坐标作图，得到一条曲线，称为标准曲线，或称为工作曲线，也称为A-c曲线。如图4-3所示。根据朗伯-比尔定律，吸光度和吸光物质的浓度成正比，标准曲线应该是一条通过原点的直线。如果标准工作曲线发生弯曲，这种现象称为偏离光的吸收定律，如图4-4所示。
图4-3 标准曲线示意图
图4-4 偏离光的吸收定律示意图
导致标准曲线弯曲的因素主要有两个方面。
（一）化学因素
1.吸光性物质溶液的浓度
严格地说，光的吸收定律通常只适用于稀溶液。当吸光性物质溶液的浓度比较大（一般大于0.01mol/L）时，会产生偏离光的吸收定律的现象。其原因有二：一是由于浓度较大时，吸光质点间的平均距离缩小，邻近质点彼此的电荷分布会相互影响，使每个质点吸收特定波长光波的能力有所改变，吸收系数随之改变；二是由于浓度较大时，溶液对光的折射率发生改变，致使测定到的吸光度产生偏离。浓度过低时，吸光性物质溶液和参比溶液的吸光性差别过小，测定的吸光度也会发生偏离。
2.吸光性物质的化学变化
溶液中的吸光性物质常因离解、缔合、形成新化合物或互变异构等化学变化而使待测物质浓度或组成发生改变，导致偏离光的吸收定律。
3.溶剂的影响
不同种类的溶剂，会对吸光性物质的吸收峰高度、最大吸收波长产生影响，还会对待测物质的物理性质和化学组成产生影响，导致偏离光的吸收定律。
（二）光学因素
1.非单色光的影响
光的吸收定律通常只适用于单色光。在实际工作中，由紫外-可见分光光度计的单色器所获得的入射光并非纯粹的单色光，而是具有一定波长范围的“复合光”，引起溶液对光的吸收定律发生偏离。
2.杂散光的影响
由紫外-可见分光光度计的单色器所获得的单色光中，还混杂一些不在谱带宽度范围内（与所需的光波长不符）的光，称为杂散光，会导致偏离光的吸收定律。
3.非平行光的影响
光的吸收定律通常只适用于平行光。在实际测定中，通过吸收池的入射光，并非真正的平行光，而是稍有倾斜的光束，倾斜光通过吸收池的实际光程（液层厚度）比垂直照射的平行光的光程要长，使吸光度的测定值偏大，导致偏离光的吸收定律。
4.反射现象的影响
入射光通过折射率不同的两种介质的界面时，有一部分光被反射而损失，使吸光度的测定值偏大，导致偏离光的吸收定律。
5.散射现象的影响
光波通过溶液时，溶液中的质点对其有散射作用，有一部分光会因散射而损失，使吸光度的测定值偏大。当吸光性物质以胶体、乳浊液或悬浮物形式存在时，散射现象更加严重。
六、吸收光谱曲线
在待测物质溶液浓度和液层厚度一定的条件下，用不同波长的入射光分别测定待测物质溶液的吸光度，以波长（λ）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标所描绘的曲线，称为吸收光谱曲线，简称吸收曲线，有时也称为A-λ曲线或吸收光谱，如图4-5所示。曲线上的凸起部分称为吸收峰；吸收峰所对应的波长称为最大吸收波长，常用λmax表示。从图4-5可以看出，KMnO4溶液的λmax=525nm，说明KMnO4溶液对525nm附近的绿色光有最大吸收，而对紫色光（400～450nm）和红色光（650～760nm）吸收很少，故KMnO4溶液呈现绿色光的互补色光颜色紫红色。
比较图4-5中三种不同浓度的KMnO4溶液的吸收光谱曲线后，得到如下结论。
图4-5 高锰酸钾溶液的吸收曲线
（1）同种溶液对不同波长的光的吸收程度不同，溶液对最大吸收波长（λmax）的光吸收程度最大。为了获得较高的测定灵敏度，常用最大吸收波长（λmax）的光作为入射光。
（2）在相同条件下，同一物质的不同浓度的溶液，其吸收光谱曲线相似，且λmax相同，说明物质吸收不同波长光的特性，只与溶液中物质的结构有关，而与浓度无关，这是分光光度分析法进行定性分析的依据。
（3）同一物质的不同浓度的溶液，入射光波长一定时，浓度越大，吸光度也越大，这是分光光度分析法进行定量分析的基础。