第三章 药物的鉴别

第一节 药物鉴别的目的和内容

一、药物鉴别的目的和特点

药物的鉴别是根据药物的分子结构及理化性质，采用化学、物理化学或生物学等方法来判断其真伪的一类方法。它是药品质量检验工作中的首项任务，只有经鉴别确定被分析药物的真实性后，才有必要进行杂质检查和含量测定。

（一）药物鉴别的目的

药物的鉴别试验就是依据药物的组成、结构与性质，采用化学、物理化学或生物学方法来判断药物的真伪。它是药品质量检验工作中的首项任务，只有在药物鉴别无误的情况下，进行药物的杂质检查、含量测定等分析工作才有意义。

药典中鉴别项下规定的试验方法，仅适用于鉴别药品的真伪，对于原料药还应结合性状项下的外观和物理常数进行确认。

（二）药物鉴别的特点

药物鉴别不同于一般化学试剂的鉴别，它具有以下几个特点。

（1）药物鉴别为已知物的确证试验。根据药典、药品标准等鉴别药物时，供试品都是已知物，鉴别的目的是确证供试品的真伪，而不是鉴定未知物的组成和结构。

（2）鉴别试验是个别分析，而不是系统分析。其试验项目比较少，一般在四五个项目以内，有的只做一两项试验就可以做出明确结论。

（3）通常选用药物的化学鉴别反应，红外特征吸收、紫外可见特征吸收，测定熔点、色谱行为、生物活性、旋光性、折射率或放射特性等不同方法鉴别同一种供试品，综合分析试验结果，做出判断。

（4）鉴别制剂时，要注意消除辅料的干扰。鉴别复方制剂中的不同成分时，要注意消除各成分间的干扰。

二、药物鉴别的内容

药物鉴别的内容主要包括性状鉴别、一般鉴别和专属鉴别试验。《中国药典》中鉴别项下规定的试验方法，仅适用于鉴别药物的真伪。对于原料药，还应结合性状项下的外观和物理常数进行确认，作为鉴别试验的补充。

（一）性状鉴别

药物的性状反映了药物特有的物理性质，包括药品的外观、臭、味、溶解度以及物理常数等。

1．外观性状

外观性状是指药物的色泽和外表感观，其在一定程度上反映了药物的内在质量。外观性状主要包括药品的外观（药物的聚集状态、晶型、色泽）、臭、味、引湿性等。但由于生产工艺的差异以及贮存环境等因素的影响，外观性状可能发生变化。因此，可根据药物的外观性状对药品质量作出初步的评价。

2．溶解度

溶解度是药物的一种物理性质，在一定程度上反映了药品的纯度。药物的溶解度既可供精制或制备溶液时参考，也可根据药物在特定溶剂中的溶解性能作质量控制。药品在不同溶剂中的溶解性能，《中国药典》用“极易溶解、易溶、溶解、略溶、微溶、极微溶解、几乎不溶或不溶”来描述。

3．物理常数

物理常数是表示药品物理性质的重要特征常数，在一定的条件下是完全不变的。测定药品的物理常数不仅对药品具有鉴别意义，也可反映药品的纯度，是评价药品质量的主要指标之一。《中国药典》收载的物理常数有相对密度、馏程、熔点、凝点、比旋度、折光率、黏度、吸收系数、碘值、皂化值及酸值等。下面介绍几个常用的物理常数。

（1）相对密度：相对密度系指在相同的温度、压力条件下，某物质的密度与水的密度之比。除另有规定外，均指20℃时的比值。纯物质的相对密度在特定条件下是不变的常数。但若物质的纯度不同，其相对密度的测定值会随着纯度的变化而改变。

《中国药典》二部附录收载的测定方法，有比重瓶法和韦氏比重秤法。比重瓶法只限于测定液体药品；韦氏比重秤法只限于测定挥发性液体药品。如药品为固体，则按该药品项下规定的方法测定。

（2）馏程：馏程系指某种液体依照药典方法蒸馏，校正到标准压力[101.3kPa（760mmHg）]下，自开始馏出第5滴算起，至供试品仅剩3～4mL或一定比例的容积馏出时的温度范围。有的液体药品具有一定的馏程，可以用来鉴别和纯度检查。

（3）熔点：熔点系指一种物质按规定方法测定，由固体熔化成液体的温度或融熔同时分解的温度或在熔化时初熔至全熔经历的温度范围。熔点是多数固体有机药物的重要物理常数。如果被测药物含有杂质，其熔点往往较其纯品为低，且熔程较长。因此，根据药物熔点的变化和熔程的长短可以判断药物的纯度。

《中国药典》共收载三种方法，第一法用于测定易粉碎的结晶性固体药品，如各种结晶型药物；第二法用于测定不易粉碎的固体药品，如脂肪、石蜡、羊毛脂；第三法用于测定凡士林等非固体药品。

（4）比旋度：比旋度系指在一定的波长与温度下，偏振光透过1dm且每1mL中含有旋光物质1g的溶液时的旋光度。分子中含有不对称元素（通常为碳原子）的有机化合物具有旋光性。比旋度为旋光物质的一个特征常数。

比旋度是反映手性药物特性及其纯度的主要指标，除了用于药物的真伪鉴别、纯度检查外，还可用于药物制剂的含量测定。手性物质的旋光性与它的生物活性密切相关。有许多药物，其左旋体和右旋体的生物活性是不同的。所以，为保证药品质量，药典规定具有旋光性的药品（如克拉霉素、硫酸奎宁、肾上腺素、葡萄糖等）要作比旋度测定。通常是在规定条件下（温度、波长、溶剂、浓度等）测出供试品的旋光度，再计算出供试品的比旋度，与规定的比旋度比较是否一致，以判断是否符合规定。

（5）折光率：折光率系指光线在空气中行进的速度与在供试品中行进速度的比值。折光率对于液体药品，尤其是植物油，是一种很有意义的物理常数。

折光率除了用于药物的鉴别、纯度检查外，还可用于某些液体制剂的含量测定。一些植物油、挥发油和液态药物需测定其折光率。应当指出的是，药品的折光率因温度或入射光波长的不同而改变。透光物质的温度升高，折光率变小；入射光的波长越短，折光率越大。因此，测定药品的折光率时应标明温度和波长。

（6）吸收系数：吸收系数系指在特定的波长、溶剂和温度等条件下，吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸光度。吸收系数有两种表示方式，分别是摩尔吸收系数（ε）和百分吸收系数（）。摩尔吸收系数是指一定波长时，溶液浓度为1mol/L，厚度为1cm时的吸光度；百分吸收系数是指一定波长时，溶液浓度为1%（W/V），厚度为1cm的吸光度。其中，百分吸收系数是《中国药典》收载的方法，它是吸光物质的重要物理常数，不仅可用于药物的鉴别，同时可作为紫外-可见分光光度法测定药物制剂含量的依据。

（二）一般鉴别

一般鉴别试验是根据某一类药物相同的化学结构特征以及相同的理化性质，通过化学反应来鉴别药物的真伪、区别不同类别药物的方法。一般鉴别属于药物类别的鉴别试验，只能证实是某一类药物，而不能证实是哪一种药物。当鉴别的药物为数种化学药物的混合物或有干扰物质存在时，除非另有规定，否则是不适宜的。《中国药典》二部附录中列有“一般鉴别试验”，项目包括无机金属盐类、无机酸盐、有机酸盐、卤化物及其他类药物（包括丙二酰脲类、托烷生物碱类、芳香第一胺类等）。

（三）专属鉴别

专属鉴别试验是根据药物化学结构的差异及其理化特性的不同，选择特有且灵敏的定性反应来鉴别某一种药物真伪的方法。专属鉴别属于药物品种的鉴别试验，主要用于证实是哪一种药物。它是在一般鉴别试验的基础上，利用各种药物的化学结构差异，来区分同类药物或具有某些相同化学结构的各个药物单体，达到最终确证药物真伪的目的。

第二节 常用的药物鉴别方法

药物鉴别方法要求专属性强，重现性好，灵敏度高，且操作简便、快速等。常用的药物鉴别方法有化学鉴别法、分光光度法、色谱法及生物学法。

一、化学鉴别法

化学鉴别法是根据药物与化学试剂在一定条件下发生离子反应或官能团反应产生不同颜色，或生成不同沉淀，或放出不同气体，或呈现不同荧光，从而做出定性分析的结论。如果供试品的反应现象与质量标准中鉴别项目规定的反应现象相同，则认定为是同一种药物。

（一）呈色反应鉴别法

呈色反应鉴别法系指供试品溶液中加入适当的试剂溶液，在一定条件下进行反应，生成易于观测的有色产物。常用的反应类型如下。

（1）三氯化铁呈色反应：一般含有酚羟基或水解后产生酚羟基。

（2）重氮化偶合显色反应：一般含有芳伯氨基或能产生芳伯氨基。

（3）茚三酮呈色反应：一般在其化学结构中含有脂肪氨基。

（4）异羟肟酸铁反应：一般多为芳酸及其酯类、酰胺类。

（5）双缩脲显色反应：一般含有氨基醇结构。

（二）沉淀反应鉴别法

沉淀反应鉴别法系指供试品溶液中加入适当的试剂溶液，在一定条件下，反应生成不同颜色的沉淀。常用的反应类型如下。

（1）与重金属离子的沉淀反应：一般为巴比妥类药物和芳酰胺类药物。

（2）与硫氰化铬胺（雷氏盐）的沉淀反应：一般为生物碱及其盐类，以及具有芳香环的有机碱及其盐类。

（三）荧光反应鉴别法

荧光反应鉴别法系指在适当的溶剂中药物本身可发射荧光，或药物与适当试剂反应后发射出荧光。常用的反应类型如下。

（1）药物本身在可见光下发射荧光：一般为含有芳环或高度共轭的脂肪族基团的药物。

（2）药物溶液加硫酸呈酸性后在可见光下发射荧光：一般为苯并二氮杂类、生物碱类、甾体激素类及中成药等。

（3）药物氧化后在可见光下发射荧光：一般为肾上腺素类、肾上腺皮质激素类药物。

（4）药物经水解后在可见光下发射荧光：如氨苄西林在酸性条件下水解，可生成荧光产物。

（四）气体生成反应鉴别法

气体生成反应鉴别法系指药物经酸、碱、加热、水解处理后产生特征气体。常用的反应类型如下。

（1）产生氨气：大多数胺（铵）类、酰脲类、酰胺类药物经强碱处理生成氨气。

（2）产生硫化氢气体：含硫药物经强酸处理后，加热生成硫化氢气体。

（3）产生碘蒸气：含碘有机药物，经直火加热，可生成紫色碘蒸气。

（4）产生乙酸乙酯香味：含醋酸酯或乙酰胺类药物，经硫酸水解后，加乙醇可产生乙酸乙酯香味。

（五）焰色反应鉴别法

焰色反应鉴别法系指某些金属元素在无色火焰中燃烧时，使火焰呈现特征颜色的反应。主要用于鉴别金属盐类药物。常用的反应类型如下。

（1）产生鲜黄色：一般为含钠离子的药物。

（2）产生紫色：一般为含钾离子的药物。

（3）产生砖红色：一般为含钙离子的药物。

（4）产生黄绿色：一般为含钡离子的药物。

（5）产生胭脂红色：一般为含锂离子的药物。

（六）熔点测定鉴别法

熔点测定鉴别法系指某些药物与试剂发生反应，可生成难溶性的、有固定熔点的衍生物，经滤过、洗涤、干燥后，测定衍生物的熔点，以进行鉴别。例如，某些巴比妥类、芳胺类、甾体激素类药物以及维生素D等药物，均可采用此法进行鉴别。

二、分光光度法

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内对光的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。常用的有紫外-可见分光光度法、红外分光光度法等。其波长范围分别为：紫外光在200～400nm范围内，可见光在400～760nm范围内，红外光在2.5～25μm（相应的波数为4000～400cm-1）范围内。

（一）紫外-可见分光光度法

有机化合物分子结构中如含有共轭体系、芳香环等发色基团，均可在紫外或可见光区有特征吸收，且药物的结构不同，会得到不同的紫外光谱，据此可对药物进行鉴别。

该方法应用范围广，使用频率高。但因吸收光谱较为简单，吸收曲线形状变化不大，缺乏精细结构，故用作鉴别的专属性远不如红外分光光度法。为了提高其专属性，可在指定溶剂中测定2～3个特定波长处的吸光度比值（峰值之比或峰值与峰谷之比）。如果能明确测定的波长范围，则更为严谨。当一个药物其多个吸收峰的峰值相差较大时，如果采用单一浓度的供试品溶液进行测定不易观察到全部的吸收峰，则可以采用两种浓度的供试品溶液分别测定其最大吸收波长。常用的鉴别方法有：

（1）对比光谱的特征参数：常用于鉴别的光谱特征参数是最大吸收波长（λmax）和最大吸收波长处的吸收系数（）。另外，图谱中的最小吸收波长（λmin）、末端吸收、肩峰等特征也应作为鉴定依据，更全面地反映光谱的特征。

（2）比较吸光度比值的一致性 有些药物不止一个吸收峰，可测定不同吸收峰处吸光度的比值作为鉴别依据。因为在溶液浓度和吸收池厚度相同的条件下，吸光度比值就是吸收系数的比值，这个比值是一定的。

3．比较吸收光谱的一致性 供试品溶液和对照品溶液按药品质量标准在规定波长区域内绘制吸收曲线，供试品和对照品的图谱（吸收曲线的峰位、峰形和相对强度）应一致。

紫外可见吸收光谱易受分子中结构、测定条件等多种因素的影响，导致其专属性不强，有一定的局限性。因此，该法大都与其他方法结合进行鉴别。

（二）红外分光光度法

药物的红外光谱能反映其分子的结构特点，具有专属性强、准确度高的特点，是验证已知药物的有效方法。主要适用于组分单一、结构明确的原料药。特别是当药物化学结构比较复杂，且相互之间差异较少，用化学鉴别法或紫外-可见分光光度法不足以相互区分时，采用红外分光光度法常可有效地解决。国内外药典广泛使用该法鉴别药物的真伪，且鉴别品种不断增加。

《中国药典》采用标准图谱对照法，即将实测的供试品红外光吸收图谱与国家药典委员会编订的《药品红外光谱集》的标准对照图谱进行比对，要求峰位、峰形、相对强度应一致。常用的方法如下。

（1）原料药鉴别：除另有规定外，应按照《药品红外光谱集》收载的各光谱所规定的方法制备样品。采用固体制样技术时，最常遇到多晶现象。固体样品的晶型不同，其红外光谱往往也会产生差异。当供试品的实测光谱与《药品红外光谱集》所收载的标准光谱不一致时，在排除各种可能影响的外在因素或人为因素后，应按该药品光谱图中备注的方法或各品种项下规定的方法进行预处理，再绘制光谱，进行比对。有两种情况：①如果未规定该品种供药用的晶型或预处理方法，则可使用对照品，并采用适当的溶剂对供试品和对照品在相同的条件下同时进行重结晶，然后依法绘制光谱，进行比对；②如果已规定特定的药用晶型，则应采用相应晶型的对照品，依法比对。

（2）制剂鉴别：品种鉴别项下应明确规定制剂的前处理方法，通常采用溶剂提取法。提取时应选择适宜的溶剂，以尽可能减少辅料的干扰，并力求避免导致可能的晶型。提取的样品再经适当干燥后依法进行红外光谱鉴别。比对时应注意以下四种情况：①辅料无干扰，待测成分的晶型不变化，可直接与原料的标准光谱进行比对；②辅料无干扰，但待测成分的晶型有变化，可用对照品经同法处理后的光谱比对；③待测成分的晶型不变化，而辅料存在不同程度的干扰，可参照原料药的标准光谱，在指纹区选择3～5个不受辅料干扰的待测成分的特征谱带作为鉴别的依据，鉴别时实测谱带的波数误差应小于规定值0.5%; ④待测成分的晶型有变化，辅料也存在干扰，一般不宜采用红外光谱鉴别。

另外，由于各种型号的仪器性能不同，供试品制备时研磨度的差异或吸水程度不同等原因，均会影响光谱的形状。因此，进行光谱比对时，应考虑各种因素可能造成的影响。

三、色谱鉴别法

色谱鉴别法是利用物质在相对运动的两相中溶解吸附、离子交换或其他亲和作用的差异来进行分离，然后再逐一进行分析的方法。由于色谱法是先将混合物中各组分分离，而后逐个分析，因此是分析混合物最有力的手段。色谱法具有高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快及应用范围广等优点，在各国药典中广泛用于药品的定性鉴别、纯度检查和含量测定。常用的方法有薄层色谱法、高效液相色谱法和气相色谱法。

（一）薄层色谱法

薄层色谱法系将供试品溶液点样于薄层板上，经展开、显色后所得的色谱图，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用于药品的鉴别或杂质检查的方法。薄层色谱鉴别的依据，是在固定的色谱条件下，相同物质的比移值（Rf）应相同。薄层色谱法是一种简单易行的鉴别方法，药典常采用该法进行鉴别。具体操作方法有：

（1）采用同浓度的对照品溶液，在同一块薄层板上点样、展开与检视，供试品溶液所显主斑点的颜色（或荧光）与位置（Rf）应与对照品溶液的主斑点一致，而且主斑点的大小与颜色的深浅也应大致相同。

（2）采用供试品溶液与对照品溶液等体积混合，应显示单一、紧密的斑点。

（3）选用与供试品化学结构相似的药物对照品与供试品溶液的主斑点比较，两者Rf不同。

（4）选用与供试品化学结构相似的药物对照品与供试品溶液等体积混合，应显示两个清晰分离的斑点。

（二）高效液相色谱法和气相色谱法

一般按药典中供试品“含量测定”项下规定的高效液相色谱法或气相色谱法的条件进行试验。要求供试品和对照品色谱峰的保留时间应一致。含量测定方法为内标法时，要求供试品溶液和对照品溶液色谱图中药物峰的保留时间与内标物峰的保留时间比值相同。

四、生物学法

生物鉴别法系利用药效学和分子生物学的方法对药物进行鉴别。主要用于抗生素、生化药物及中药的鉴别，通常分为生物效应鉴别法和基因鉴别法两大类。

除上述四种方法外，旋光度法、折射率法、显微镜及偏光显微镜法等也用于药物的鉴别。《中国药典》还采用其他方法对药物进行鉴别。例如，放射性药物用测定半衰期和能谱的方法进行鉴别。

第三节 药物鉴别的条件

鉴别试验是根据药物的性质，选择一些现象明显、易于观察的特征变化进行鉴别。因此，为了使鉴别结果准确可靠，必须严格控制能影响鉴别试验的各种因素。

一、溶液的浓度

溶液的浓度主要指被鉴别物质的浓度，其大小会对某些鉴别试验结果产生一定的影响。如化学法中观察颜色、沉淀，若被检测化合物的浓度太低，则颜色太浅或沉淀不明显。另外，紫外-可见分光光度法中的A值也受药物浓度的影响。

二、溶液的温度

溶液的温度影响化学反应的速度，一般温度每升高10℃，反应速度会增加2～4倍。但温度的升高也可能使某些生成物发生分解，导致溶液颜色变浅、沉淀溶解，甚至不能观察到试验结果。故试验中应注意温度的影响，尽量保持恒温。

三、溶液的酸碱度

许多鉴别反应需要在一定酸碱度的条件下才能进行。适当的酸碱度能使反应物处于活性状态，并使反应生成物处于稳定和易于观察的状态。因此，鉴别反应中应严格按照规定的溶液酸碱度进行试验。

四、干扰成分的存在

在鉴别试验中，药物结构中的其他部分，或药物制剂中的其他成分（如辅料等），也可能参与鉴别反应，而对检验现象产生干扰。此时可采取掩蔽、提取分离或选择专属性更高的鉴别方法排除干扰后，再进行试验。

五、反应的介质

化学反应的环境也称为化学反应的介质，介质不但决定物质呈现的形态，而且介质不同还会导致反应产物不同，产生的现象也不同。因此，鉴别试验需要在适宜的介质中进行。

从上述讨论可以看出，有多种因素影响鉴别试验。因此，在建立鉴别试验方法时，应考察鉴别条件对试验结果的影响，选取最佳的鉴别试验条件；在按照药品质量标准的方法进行鉴别时，则应严格按照规定的条件进行试验。

思考题

1．试述鉴别药物的目的和特点。

2．什么是一般鉴别试验？什么是专属鉴别试验？

3．《中国药典》规定药物鉴别的主要内容有哪些？

4．常用的药物鉴别试验方法有哪些？

5．请简述药物鉴别的条件。